Meristem merupakan kumpulan sel-sel yang aktif membelah pada tempat tertentu pada tanaman, dimana sel-sel tersebut akan membentuk sistem jaringan secara permanen seperti akar, tunas, daun, bunga dan lain-lain. Sel-sel jaringan meristem mempunyai kemampuan embrionik yang dapat membelah tanpa batas untuk membentuk jaringan dewasa untuk kemudian menjadi organ-organ tanaman.
Bentuk dan ukuran titik tumbuh meristem berbeda antara tanaman yang satu dengan lainnya tergantung kelompok tanaman secara taksonomik. Meristem pada tunas tanaman yang tergolong dikotil mempunyai lapisan sel-sel yang membentuk kubah yang sel-selnya aktif membelah berukuran diameter sekitar 0.1-0.2 mm dan panjang 0.2-0.3 mm. Meristem tidak mempunyai vaskuler yang terhubung dengan jaringan phloem dan xylem pada batang. Dibawah sel meristem terdapat sel-sel yang membelah dan memanjang yang berkembang menjadi primordia daun.
Kultur meristem merupakan salah satu metoda dalam teknik kultur jaringan dengan menggunakan eksplan berupa jaringan meristematik baik meristem pucuk terminal atau meristem dari tunas aksilar. Tujuan utama aplikasi kultur meristem adalah mendapatkan dan memperbanyak tanaman yang bebas virus (eliminasi virus dari bahan tanaman). Kultur meristem sebagai metoda untuk perbanyakan tanaman yang bebas virus sudah secara luas diaplikasikan terutama pada tanaman hortikultura. Sel-sel meristem pada umumnya stabil, karena mitosis pada sel-sel meristem terjadi bersama dengan pembelahan sel yang berkesinambungan, sehingga ekstra duplikasi DNA dapat dihindarkan. Hal ini menyebabkan tanaman yang dihasilkan identik dengan tanaman donornya (Gunawan, 1988). Jaringan meristem merupakan jaringan vegetatif sehingga plantlet yang dihasilkannyapun merupakan suatu klon. Oleh karena itu kelompok tanaman yang dihasilkan dari kultur meristem sering disebut mericlone.
Morel dan Martin (1952) merupakan orang pertama yang berhasil menumbuhkan meristem tanaman dahlia yang terserang virus dan memperoleh tanaman yang bebas virus. Setelah itu penggunaan kultur meristem terhadap berbagai jenis tanaman banyak dikembangkan. Pada tahun 1960 Morel berhasil memperbanyak tanaman Cymbidium yang bebas virus. Dari hasil perbanyakan kultur meristem anggrek tersebut, Morel menemukan pembentukan kalus terlebih dahulu. Dan dari kalus tersebut kemudian membentuk struktur yang serupa dengan perkembangan awal dari perkecambahan biji anggrek sebelum menjadi tanaman. Struktur tersebut disebut dengan protocorm. Protocorm akan memperbanyak diri menjadi massa protocorm yang baru apabila ditumbuhkan pada media tumbuh yang sama dan akan tumbuh menjadi tanaman lengkap (plantlet) apabila dipindahkan ke media pendewasaan dan perakaran.
Berbeda dengan Morel yang telah berhasil mengklonkan tanaman anggrek melalui protocorm, Hussey dan Stacey (1960) memperbanyak tanaman kentang secara massal yang bebas virus melalui subkultur tunas aksiler secara berulang. Eksplan tunas kentang yang sudah bebas virus dijadikan eksplan awal ditumbuhkan pada media perbanyakan yang menghasilkan tunas dengan buku-buku yang mengandung tunas ketiak disetiap bukunya. Tiap bulan dapat dihasilkan rata-rata 3-5 buku. Setiap empat minggu buku-buku tersebut dipotong untuk dikulturkan ke media baru. Setelah empat minggu dipotong-potong lagi. Demikian seterusnya sehingga dalam satu tahun dapat dihasilkan jutaan tanaman.
Keberhasilan kultur meristem tergantung pada beberapa faktor, diantaranya media kultur, keadaan fisiologis eksplan dan lingkungan fisik tumbuh. Sering terjadi bahwa jaringan meristem yang ditanam tidak menunjukkan proses morfogenesis, hal ini disebabkan sel-sel dari eksplan tidak mengadakan pembelahan dan berdiferensiasi. Jaringan meristem merupakan jaringan yang sel-selnya aktif membelah, biasanya jaringan ini akan mempunyai daya hidup yang lebih besar dan dapat beregenerasi dengan baik apabila ditanam bersama dengan daun primordianya. Akan tetapi lebih disarankan apabila tujuannya untuk mendapatkan tanaman bebas virus sebaiknya meristem ditanam tanpa disertakan daun primordia.
Perbanyakan tanaman kentang melalui kultur meristem untuk eliminasi virus dapat dicontohkan seperti yang dilakukan di Balai Penelitian Tanaman Sayuran (Balitsa) Lembang yaitu sebagai berikut:
Sebagai sumber eksplan adalah tunas-tunas yang tumbuh dari umbi berukuran 3-5 cm. Titik tumbuh / jaringan meristem yang diambil berukuran 0.25-0.4 mm dengan menggunakan skalpel atau jarum. Pengambilan meristem dilakukan dibawah mikroskop binokuler (pembesaran 25-40 kali) dalam lingkungan steril (dalam laminar airflow). Meristem ditanam secara in vitro pada media dasar MS yang ditambah suplemen sukrosa 30 g/l, myo-inositol 100 mg/l, GA3 0.1-0.25 mg/l, agar 7 g/l, pH 5.6-5.7. Biakan kemudian diinkubasi di ruang kultur dengan suhu 20-22oC, dengan diberi penerangan 1000-2000 lux selama 16 jam per hari. Subkultur dilakukan setelah jaringan meristem tumbuh dan berkembang menjadi plantlet. Pada umumnya jaringan meristem akan tumbuh dan berkembang menjadi plantlet setelah 3-6 bulan stelah tanam. Plantlet kemudian diperbanyak dengan metoda penanaman stek satu buku pada media MS yang diperkaya air kelapa 100 ml/l, gula 30 g/l, GA3 0.15 mg/l, agar 7 g/l, pH 5.7. Biakan disimpan pada kondisi yang sama dengan kultur meristem. Stek mikro tersebut umumnya dapat diperbanyak kembali setelah berumur 3-5 minggu (Gambar F-6.3).
Kamis, 22 Oktober 2009
KULTUR KALUS DAN SEL
Induksi dan Kultur Kalus
Kalus adalah kumpulan sel-sel yang terbentuk dari sel-sel parenkhima yang membelah secara terus menerus dan tidak terorganisir. Di alam (in vivo) fenomena pembentukan kalus terjadi pada penyakit tumor tanaman yang disebabkan infeksi oleh mikroorganisme bakteri Agrobacterium tumefaciens pada bagian tanaman yang terluka akibat gigitan serangga atau nematoda. Kalus yang diinisiasi dan dipelihara dalam media secara in vitro dapat digunakan untuk tujuan mempelajari pertumbuhan dan perkembangan tanaman atau dieksploitasi untuk tujuan perbanyakan tanaman. Keberhasilan induksi kalus ditentukan oleh: (i) pemilihan bahan tanaman atau eksplan, dan (ii) media dan kondisi kultur yang cocok. Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi organ dan jenis tanaman yang berbeda akan menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda pula. Embrio zigotik muda dalam biji tanaman, hipkotil, kotiledon, daun dan batang muda adalah contoh-contoh eksplan yang sangat respon untuk pembentukan kalus.
Pembelahan sel dari jaringan eksplan yang membentuk kalus biasanya hanya terjadi dari bagian lapisan periphery saja. Menurut Yeoman (1970), hal ini disebabkan oleh beberapa faktor antara lain: (i) ketersediaan O2 yang lebih tinggi, (ii) keluarnya gas CO2, (iii) ketersediaan hara yang lebih banyak, (iv) penguapan yang lebih cepat dari penghambat yang bersifat folatik, dan (v) cahaya. Jaringan dari eksplan batang, akar atau daun terdiri dari berbagai macam sel sehingga akan menghasilkan kalus yang heterogenous. Bahkan jaringan yang tampak seragam secara histologi seperti pembuluh tembakau dan akar ercis menghasilkan kalus dengan sel dengan DNA yang berbeda karena tingkat ploidi yang berbeda (Yeoman, 1970; Torey, 1961 dalam Gunawan, 1988). Heterogenitas dari sel-sel yang membentuk kalus selain berasal dari materi asalnya juga dapat terjadi karena masa kultur yang panjang melalui subkultur yang berulang-ulang. Menurut Gunawan (1988), perubahan dapat terjadi karena: (i) aberasi kromosom, (ii) mutasi gen, (iii) endoreduplikasi yang menghasilkan poliploidi, (iv) transposisi urutan DNA, (v) amplifikasi gen atau (vi) hiangnya satu gen.
Agar kalus dapat dijaga pertumbuhannya dan dapat diperbanyak secara berkesinambungan, maka perlu dipindahkan secara teratur pada media baru dalam jangka waktu terentu (subkultur). Apabila kalus disubkultur pada media agar yang dilakukan secara regular, maka akan menunjukkan fase pertumbuhan kurva S (sigmoid). Phillips et al., (1995) membagi lima fase pertumbuhan kalus, yaitu:
• Fase lag, dimana sel-sel mulai membelah;
• Fase eksponensial, dimana laju pembelahan sel berada pada puncaknya;
• Fase linear, dimana pembelahan sel mengalami perlambatan tetapi laju ekspansi sel meningkat;
• Fase deselerasi, dimana laju pembelahan dan pemanjangan sel menurun, dan;
• Fase stationer, dimana jumlah dan ukuran sel tetap.
Menurut Thorpe (1982), kalus yang dipelihara dalam kultur sering mengalami perubahan sejalan dengan waktu, antara lain karena: (i) hilangnya hormon pertumbuhan yang diperlukan; (ii) hilangnya potensi morfogenetik, dan (iii) perubahan tekstur morfologis dari jaringan (jaringan yang ”friable”). Semua perubahan tersebut akan menurunkan daya regenerasi jaringan. Dalam beberapa kasus kehilangan daya morfogenetik dari kalus tersebut dapat dikembalikan dengan cara memindahkan kalus pada media yang mengandung sitokinin pada konsentrasi tinggi dalam periode kultur yang singkat atau melakukan subkultur yang berulang pada media untuk pembentukan tunas (Rice, et al., 1978).
2. Kultur Suspensi Sel
Suspensi sel adalah kumpulan atau agregat-agregat sel yang berasal hasil pemindahan potongan kalus kedalam botol kultur berisi medium cair yang disimpan di atas alat penggojok (“gyratory shaker”). Penggojokan dilakukan untuk tujuan penyediaan aerasi bagi sel-sel tersebut, pemecahan gumpalan sel menjadi agregat yang kecil atau sel tungal dan untuk distribusi sel yang merata dalam media kultur. Inisiasi kultur suspensi sel umumnya dilakukan dengan cara yang sederana yaitu dengan memindahkan kalus segar kedalam media cair dalam botol erlenmeyer dan dikocok dengan meletakannya diatas shaker dengan kecepatan antara 70-100 rpm (Gambar D-4.2).
Umumnya sel-sel dalam suspensi menunjukkan laju pembelahan sel yang lebih tinggi dibandingkan dengan sel-sel dalam kultur kalus. Oleh karena itu suspensi sel memberikan keuntungan apabila kita menginginkan pembelahan sel yang cepat dan generasi sel yang banyak atau apabila diperlukan aplikasi perlakuan yang seragam selama prosedur seleksi sel. Pertumbuhan suspensi sel dapat dimonitor berdasarkan satuan volume sel yang berkorelasi dengan pertumbuhan berat segar. Densitas sel dapat diperkirakan dan dipantau mengunakan alat hemacytometer.
Kultur suspensi sel merupakan metoda yang cocok untuk mempelajari metabolisme sel, pengaruh berbagai persenyawaan ada sel, serta diferensiasi sel. Aplikasi kultur suspensi sel banyak digunakan sebagai: (i) sumber sel untuk mendapatkan protoplasma; (ii) sumber sel yang akan diberi perlakuan induksi mutasi; (iii) bahan untuk mempelajari hubungan inang dan penyakit dalam fitopatologi; (iv) metoda produksi bahan metabolit sekunder; dan (v) sumber sel untuk media seleksi.
Sisitim pemeliharaan suspensi sel dapat dilakukan dengan cara kultur batch dan continous. Pada kultur suspensi sel batch, kultur dipelihara dalam media dengan volume tetap tetapi dengan konsentrasi hara yang berubah sesuai dengan tingkat pertumbuhan sel. Pada sistim ini biomasa sel akan bertambah sesuai kurva sigmoid dan setelah mencapai masa tertentu sel akan berhenti membelah karena kehabisan hara atau akumulasi senyawa metabolik yang bersifat toksik. Setelah mencapai fase ini biakan harus diperbaharui dengan cara mensubkultur sebagian sel pada media baru. Suspensi sel dengan sistim berkelanjutan (continuous system) merupakan kultur sel jangka panjang denan suplai hara yang konstan dalam wadah yang relatif lebih besar. Pada sistim ini media kultur dapat ditambahkan atau ganti dengan media baru sehingga sel-sel baru dapat terus dihasilkan. Kultur sel kontinyu terdapat dua tipe yaitu tipe tertutup (closed type) dan tipe terbuka (open type). Pada tipe tertutup, sel akan bertambah terus tanpa dipanen dan hanya media yang disirkulasi. Sedangkan pada tipe terbuka, penambahan media baru disertai dengan pemanenan sel.
Kalus adalah kumpulan sel-sel yang terbentuk dari sel-sel parenkhima yang membelah secara terus menerus dan tidak terorganisir. Di alam (in vivo) fenomena pembentukan kalus terjadi pada penyakit tumor tanaman yang disebabkan infeksi oleh mikroorganisme bakteri Agrobacterium tumefaciens pada bagian tanaman yang terluka akibat gigitan serangga atau nematoda. Kalus yang diinisiasi dan dipelihara dalam media secara in vitro dapat digunakan untuk tujuan mempelajari pertumbuhan dan perkembangan tanaman atau dieksploitasi untuk tujuan perbanyakan tanaman. Keberhasilan induksi kalus ditentukan oleh: (i) pemilihan bahan tanaman atau eksplan, dan (ii) media dan kondisi kultur yang cocok. Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi organ dan jenis tanaman yang berbeda akan menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda pula. Embrio zigotik muda dalam biji tanaman, hipkotil, kotiledon, daun dan batang muda adalah contoh-contoh eksplan yang sangat respon untuk pembentukan kalus.
Pembelahan sel dari jaringan eksplan yang membentuk kalus biasanya hanya terjadi dari bagian lapisan periphery saja. Menurut Yeoman (1970), hal ini disebabkan oleh beberapa faktor antara lain: (i) ketersediaan O2 yang lebih tinggi, (ii) keluarnya gas CO2, (iii) ketersediaan hara yang lebih banyak, (iv) penguapan yang lebih cepat dari penghambat yang bersifat folatik, dan (v) cahaya. Jaringan dari eksplan batang, akar atau daun terdiri dari berbagai macam sel sehingga akan menghasilkan kalus yang heterogenous. Bahkan jaringan yang tampak seragam secara histologi seperti pembuluh tembakau dan akar ercis menghasilkan kalus dengan sel dengan DNA yang berbeda karena tingkat ploidi yang berbeda (Yeoman, 1970; Torey, 1961 dalam Gunawan, 1988). Heterogenitas dari sel-sel yang membentuk kalus selain berasal dari materi asalnya juga dapat terjadi karena masa kultur yang panjang melalui subkultur yang berulang-ulang. Menurut Gunawan (1988), perubahan dapat terjadi karena: (i) aberasi kromosom, (ii) mutasi gen, (iii) endoreduplikasi yang menghasilkan poliploidi, (iv) transposisi urutan DNA, (v) amplifikasi gen atau (vi) hiangnya satu gen.
Agar kalus dapat dijaga pertumbuhannya dan dapat diperbanyak secara berkesinambungan, maka perlu dipindahkan secara teratur pada media baru dalam jangka waktu terentu (subkultur). Apabila kalus disubkultur pada media agar yang dilakukan secara regular, maka akan menunjukkan fase pertumbuhan kurva S (sigmoid). Phillips et al., (1995) membagi lima fase pertumbuhan kalus, yaitu:
• Fase lag, dimana sel-sel mulai membelah;
• Fase eksponensial, dimana laju pembelahan sel berada pada puncaknya;
• Fase linear, dimana pembelahan sel mengalami perlambatan tetapi laju ekspansi sel meningkat;
• Fase deselerasi, dimana laju pembelahan dan pemanjangan sel menurun, dan;
• Fase stationer, dimana jumlah dan ukuran sel tetap.
Menurut Thorpe (1982), kalus yang dipelihara dalam kultur sering mengalami perubahan sejalan dengan waktu, antara lain karena: (i) hilangnya hormon pertumbuhan yang diperlukan; (ii) hilangnya potensi morfogenetik, dan (iii) perubahan tekstur morfologis dari jaringan (jaringan yang ”friable”). Semua perubahan tersebut akan menurunkan daya regenerasi jaringan. Dalam beberapa kasus kehilangan daya morfogenetik dari kalus tersebut dapat dikembalikan dengan cara memindahkan kalus pada media yang mengandung sitokinin pada konsentrasi tinggi dalam periode kultur yang singkat atau melakukan subkultur yang berulang pada media untuk pembentukan tunas (Rice, et al., 1978).
2. Kultur Suspensi Sel
Suspensi sel adalah kumpulan atau agregat-agregat sel yang berasal hasil pemindahan potongan kalus kedalam botol kultur berisi medium cair yang disimpan di atas alat penggojok (“gyratory shaker”). Penggojokan dilakukan untuk tujuan penyediaan aerasi bagi sel-sel tersebut, pemecahan gumpalan sel menjadi agregat yang kecil atau sel tungal dan untuk distribusi sel yang merata dalam media kultur. Inisiasi kultur suspensi sel umumnya dilakukan dengan cara yang sederana yaitu dengan memindahkan kalus segar kedalam media cair dalam botol erlenmeyer dan dikocok dengan meletakannya diatas shaker dengan kecepatan antara 70-100 rpm (Gambar D-4.2).
Umumnya sel-sel dalam suspensi menunjukkan laju pembelahan sel yang lebih tinggi dibandingkan dengan sel-sel dalam kultur kalus. Oleh karena itu suspensi sel memberikan keuntungan apabila kita menginginkan pembelahan sel yang cepat dan generasi sel yang banyak atau apabila diperlukan aplikasi perlakuan yang seragam selama prosedur seleksi sel. Pertumbuhan suspensi sel dapat dimonitor berdasarkan satuan volume sel yang berkorelasi dengan pertumbuhan berat segar. Densitas sel dapat diperkirakan dan dipantau mengunakan alat hemacytometer.
Kultur suspensi sel merupakan metoda yang cocok untuk mempelajari metabolisme sel, pengaruh berbagai persenyawaan ada sel, serta diferensiasi sel. Aplikasi kultur suspensi sel banyak digunakan sebagai: (i) sumber sel untuk mendapatkan protoplasma; (ii) sumber sel yang akan diberi perlakuan induksi mutasi; (iii) bahan untuk mempelajari hubungan inang dan penyakit dalam fitopatologi; (iv) metoda produksi bahan metabolit sekunder; dan (v) sumber sel untuk media seleksi.
Sisitim pemeliharaan suspensi sel dapat dilakukan dengan cara kultur batch dan continous. Pada kultur suspensi sel batch, kultur dipelihara dalam media dengan volume tetap tetapi dengan konsentrasi hara yang berubah sesuai dengan tingkat pertumbuhan sel. Pada sistim ini biomasa sel akan bertambah sesuai kurva sigmoid dan setelah mencapai masa tertentu sel akan berhenti membelah karena kehabisan hara atau akumulasi senyawa metabolik yang bersifat toksik. Setelah mencapai fase ini biakan harus diperbaharui dengan cara mensubkultur sebagian sel pada media baru. Suspensi sel dengan sistim berkelanjutan (continuous system) merupakan kultur sel jangka panjang denan suplai hara yang konstan dalam wadah yang relatif lebih besar. Pada sistim ini media kultur dapat ditambahkan atau ganti dengan media baru sehingga sel-sel baru dapat terus dihasilkan. Kultur sel kontinyu terdapat dua tipe yaitu tipe tertutup (closed type) dan tipe terbuka (open type). Pada tipe tertutup, sel akan bertambah terus tanpa dipanen dan hanya media yang disirkulasi. Sedangkan pada tipe terbuka, penambahan media baru disertai dengan pemanenan sel.
DEFINISI, APLIKASI DAN SEJARAH KULTUR JARINGAN TANAMAN
Definisi dan Aplikasi Kultur Jaringan
Kultur jaringan tanaman adalah suatu metode atau teknik mengisolasi bagian tanaman (protoplasma, sel, jaringan, dan organ) dan menumbuhkannya pada media buatan dalam kondisi aseptik di dalam ruang yang terkontrol sehingga bagian-bagian tanaman tersebut dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman lengkap.
Penggunaan teknik kultur jaringan pada awalnya hanya untuk membuktikan teori “totipotensi” (“total genetic potential”) yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwann (1838) yang menyatakan bahwa sel tanaman sebagai unit terkecil dapat tumbuh dan berkembang apabila dipelihara dalam kondisi yang sesuai.
Saat ini teknik kultur jaringan digunakan bukan hanya sebagai sarana untuk mempelajari aspek-aspek fisiologi dan biokimia tanaman saja. Akan tetapi sudah berkembang menjadi metoda untuk berbagai tujuan seperti:
a. Mikropropagasi (Perbanyakan tanaman secara mikro)
Teknik kultur jaringan telah digunakan dalam membantu produksi tanaman dalam skala besar melalui mikropropagasi atau perbanyakan klonal dari berbagai jenis tanaman. Jaringan tanaman dalam jumlah yang sedikit dapat menghasilkan ratusan atau ribuan tanaman secara terus menerus. Teknik ini telah digunakan dalam skala industri di berbagai negara untuk memproduksi secara komersial berbagai jenis tanaman seperti tanaman hias (anggrek, bunga potong, dll.), tanaman buah-buahan (seperti pisang), tanaman industri dan kehutanan (kopi, jati, dll). Dengan menggunakan metoda kultur jaringan, jutaan tanaman dengan sifat genetis yang sama dapat diperoleh hanya dengan berasal dari satu mata tunas. Oleh karena itu metoda ini menjadi salah satu alternatif dalam perbanayakan tanaman secara vegetatif.
b. Perbaikan tanaman
Seperti telah diketahui bahwa dalam usaha perbaikan tanaman melalui metoda pemuliaan secara konvensional untuk mendapatkan suatu galur murni akan memerlukan enam atau tujuh generasi hasil penyerbukan sendiri maupun persilangan. Melalui teknik kultur jaringan, antara lain dengan cara memproduksi tanaman haploid melalui kultur polen, antera atau ovari yang diikuti dengan penggandaan kromosom, akan mempersingkat waktu untuk mendapatkan tanaman yang homozigot.
c. Produksi tanaman yang bebas penyakit (virus)
Teknologi kultur jaringan telah memberikan kontribusinya dalam mendapatkan tanaman yang bebas dari virus. Pada tanaman yang telah terinfeksi virus, sel-sel pada tunas ujung (meristem) merupakan daerah yang tidak terinfeksi virus. Dengan cara mengkulturkan bagian meristem pada media kultur yang cocok akan diperoleh tanaman yang bebas virus. Teknik ini telah banyak digunakan dalam memproduksi berbagai tanaman hortkultura yang bebas penyakit.
d. Transformasi genetik
Teknik kultur jaringan telah menjadi bagian penting dalam membantu keberhasilan rekayasa genetika tanaman (transfer gen). Sebagai contoh transfer gen bakteri (seperti gen cry dari Bacillus thuringensis) kedalam sel tanaman akan terekspresi setelah regenerasi tanaman transgeniknya tercapai.
e. Produksi senyawa metabolit sekunder
Kultur sel-sel tanaman juga dapat digunakan untuk memproduksi senyawa biokimia (metabolit sekunder) seperti alkaloid, terpenoid, phenyl propanoid dll. Teknologi ini sekarang sudah tersedia dalam skala industri. Sebagai contoh produksi secara komersial senyawa “shikonin” dari kultur sel Lithospermum erythrorhizon.
2. Sejarah Kultur Jaringan Tanaman
Penggunaan teknik kultur jaringan dimulai oleh Gottlieb Haberlandt pada tahun 1902 dalam usahanya mengkulturkan sel-sel rambut dari jaringan mesofil daun tanaman monokotil. Akan tetapi usahanya gagal karena sel-sel tersebut tidak mengalami pembelahan. Diduga kegagalannya itu karena tidak digunakannya zat pengatur tumbuh yang diperlukan untuk pembelahan sel, proliferasi dan induksi embrio. Pada tahun 1904, Hannig melakukan penanaman embrio yang diisolasi dari beberapa tanaman crucifers. Tahun 1922, secara terpisah Knudson dan Robbin masing-masing melakukan usaha penanaman benih anggrek dan kultur ujung akar.
Setelah tahun 1920-an penemuan dan perkembangan teknik kultur jaringan terus berlanjut. Berikut tabel yang menunjukkan sejarah perkembangan bidang kultur jaringan tanaman yang diadaptasi dari berbagai sumber.
Tabel A-1.1. Penemuan-penemuan penting dalam sejarah perkembangan
kultur jaringan tanaman
Tahun Penemuan-penemuan Penting
1838 Schleiden & Schwann mengemukakan teori Totipotensi
1902 Haberlandt:: Orang pertama yang mencoba mengisolasi dan mengkulturkan jaringan tanaman monokotil, tetapi gagal
1922 Knudson: mengecambahkan biji anggrek
1924 Blumenthal & Meyer: Pembentukan kalus dari eksplan akar wortel
1929 Laibach & Hered: Kultur embrio untuk mengatasi inkompatibilitas pada tanaman Linum spp.
1934 Gautheret: Kultur in vitro dari jaringan kambium tanaman berkayu dan perdu, tetapi gagal.
White: Keberhasilan kultur akar tomat dalam waktu yang panjang
Kogl et.al. : Identifikasi hormon tanaman pertama, IAA, untuk pemanjangan sel.
1936 LaRue: Kultur embrio pada beberapa tanaman gymnospermae
1939 Gautheret: Berhasil menumbuhkan kultur kambium tanaman wortel dan tembakau
1941 Overbeek: Penggunaan air kelapa untuk menumbuhkam kultur embrio muda tanaman Datura
1944 Kultur in vitro pertama dari tanaman tembakau untuk studi pembentukan tunas adventif
1948 Skoog dan Tsui: Pembentukan tunas dan akar adventif dari tembakau
1949 Nitsch: Kultur in vitro tanaman buah-buahan
1952 Morel & Martin:
Kultur meristem untuk mendapatkan tanaman Dahlia yang bebas virus
Keberhasilan pertama micro-grafting
1953 Tulecke: Kalus haploid dari polen tanaman Ginkgo biloba
1955 Miller: Penemuan struktur dan sintesa dari kinetin
1957 Skoog & Miller: Menemuan bahwa pembentukan akar dan tunas dalam kultur tergatung pada perbandingan auksin : sitokinin
1958 Maheswari & Rangaswamy: Regenerasi embrio somatik dari nuselus ovul Citrus
Reinert & Steward: Pertumbuhan dan perkembangan kultur suspensi wortel
1960 Cocking: Degradasi enzimatik dinding sel untuk mendapatkan protoplas
Morel: Perbanyakan vegetatif anggrek melalui kultur meristem
1962 Murashige & Skoog: Perkembangan media MS
1964 Guha & Maheswari: Penemuan tanaman haploid pertama melalui androgenesis tanaman Datura
1969 Erickson & Jonassen: Isolasi protoplas dari suspensi sel Hapopappus
1970 Power: Fusi protoplas
1977 Chilton: Keberhasilan integrasi T-DNA pada tanaman
Noguchi dkk.: Penanaman sel-sel tembakau dalam bioreaktor berkapasitas 20 000 L.
1978 Melchers dkk.: Hibridisasi somatik antara tanaman tomat dan kentang
Tabata dkk.: Produksi shikonin pada skala industri melalui kultur sel
1982 Zimmermann: Fusi protoplas secara elektrik (Electrofusion)
1983 Mitsui Petrochemicals: Produksi metabolit sekunder pertama dalam skala industri melalui kultur suspensi pada tanaman Lithospermum spp.
1985-1990 Perkembangan transfer gen pada tanaman berkembang cepat, seperti penggunaan Agrobacterium, particle bombardment (gen gun), electroporasi, mikroinjeksi.
1990 - Perkembangan rekayasa genetik dan metabolik tan. berkembang pesat
Pemasaran produk-produk rekayasa genetik
Kultur jaringan tanaman adalah suatu metode atau teknik mengisolasi bagian tanaman (protoplasma, sel, jaringan, dan organ) dan menumbuhkannya pada media buatan dalam kondisi aseptik di dalam ruang yang terkontrol sehingga bagian-bagian tanaman tersebut dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman lengkap.
Penggunaan teknik kultur jaringan pada awalnya hanya untuk membuktikan teori “totipotensi” (“total genetic potential”) yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwann (1838) yang menyatakan bahwa sel tanaman sebagai unit terkecil dapat tumbuh dan berkembang apabila dipelihara dalam kondisi yang sesuai.
Saat ini teknik kultur jaringan digunakan bukan hanya sebagai sarana untuk mempelajari aspek-aspek fisiologi dan biokimia tanaman saja. Akan tetapi sudah berkembang menjadi metoda untuk berbagai tujuan seperti:
a. Mikropropagasi (Perbanyakan tanaman secara mikro)
Teknik kultur jaringan telah digunakan dalam membantu produksi tanaman dalam skala besar melalui mikropropagasi atau perbanyakan klonal dari berbagai jenis tanaman. Jaringan tanaman dalam jumlah yang sedikit dapat menghasilkan ratusan atau ribuan tanaman secara terus menerus. Teknik ini telah digunakan dalam skala industri di berbagai negara untuk memproduksi secara komersial berbagai jenis tanaman seperti tanaman hias (anggrek, bunga potong, dll.), tanaman buah-buahan (seperti pisang), tanaman industri dan kehutanan (kopi, jati, dll). Dengan menggunakan metoda kultur jaringan, jutaan tanaman dengan sifat genetis yang sama dapat diperoleh hanya dengan berasal dari satu mata tunas. Oleh karena itu metoda ini menjadi salah satu alternatif dalam perbanayakan tanaman secara vegetatif.
b. Perbaikan tanaman
Seperti telah diketahui bahwa dalam usaha perbaikan tanaman melalui metoda pemuliaan secara konvensional untuk mendapatkan suatu galur murni akan memerlukan enam atau tujuh generasi hasil penyerbukan sendiri maupun persilangan. Melalui teknik kultur jaringan, antara lain dengan cara memproduksi tanaman haploid melalui kultur polen, antera atau ovari yang diikuti dengan penggandaan kromosom, akan mempersingkat waktu untuk mendapatkan tanaman yang homozigot.
c. Produksi tanaman yang bebas penyakit (virus)
Teknologi kultur jaringan telah memberikan kontribusinya dalam mendapatkan tanaman yang bebas dari virus. Pada tanaman yang telah terinfeksi virus, sel-sel pada tunas ujung (meristem) merupakan daerah yang tidak terinfeksi virus. Dengan cara mengkulturkan bagian meristem pada media kultur yang cocok akan diperoleh tanaman yang bebas virus. Teknik ini telah banyak digunakan dalam memproduksi berbagai tanaman hortkultura yang bebas penyakit.
d. Transformasi genetik
Teknik kultur jaringan telah menjadi bagian penting dalam membantu keberhasilan rekayasa genetika tanaman (transfer gen). Sebagai contoh transfer gen bakteri (seperti gen cry dari Bacillus thuringensis) kedalam sel tanaman akan terekspresi setelah regenerasi tanaman transgeniknya tercapai.
e. Produksi senyawa metabolit sekunder
Kultur sel-sel tanaman juga dapat digunakan untuk memproduksi senyawa biokimia (metabolit sekunder) seperti alkaloid, terpenoid, phenyl propanoid dll. Teknologi ini sekarang sudah tersedia dalam skala industri. Sebagai contoh produksi secara komersial senyawa “shikonin” dari kultur sel Lithospermum erythrorhizon.
2. Sejarah Kultur Jaringan Tanaman
Penggunaan teknik kultur jaringan dimulai oleh Gottlieb Haberlandt pada tahun 1902 dalam usahanya mengkulturkan sel-sel rambut dari jaringan mesofil daun tanaman monokotil. Akan tetapi usahanya gagal karena sel-sel tersebut tidak mengalami pembelahan. Diduga kegagalannya itu karena tidak digunakannya zat pengatur tumbuh yang diperlukan untuk pembelahan sel, proliferasi dan induksi embrio. Pada tahun 1904, Hannig melakukan penanaman embrio yang diisolasi dari beberapa tanaman crucifers. Tahun 1922, secara terpisah Knudson dan Robbin masing-masing melakukan usaha penanaman benih anggrek dan kultur ujung akar.
Setelah tahun 1920-an penemuan dan perkembangan teknik kultur jaringan terus berlanjut. Berikut tabel yang menunjukkan sejarah perkembangan bidang kultur jaringan tanaman yang diadaptasi dari berbagai sumber.
Tabel A-1.1. Penemuan-penemuan penting dalam sejarah perkembangan
kultur jaringan tanaman
Tahun Penemuan-penemuan Penting
1838 Schleiden & Schwann mengemukakan teori Totipotensi
1902 Haberlandt:: Orang pertama yang mencoba mengisolasi dan mengkulturkan jaringan tanaman monokotil, tetapi gagal
1922 Knudson: mengecambahkan biji anggrek
1924 Blumenthal & Meyer: Pembentukan kalus dari eksplan akar wortel
1929 Laibach & Hered: Kultur embrio untuk mengatasi inkompatibilitas pada tanaman Linum spp.
1934 Gautheret: Kultur in vitro dari jaringan kambium tanaman berkayu dan perdu, tetapi gagal.
White: Keberhasilan kultur akar tomat dalam waktu yang panjang
Kogl et.al. : Identifikasi hormon tanaman pertama, IAA, untuk pemanjangan sel.
1936 LaRue: Kultur embrio pada beberapa tanaman gymnospermae
1939 Gautheret: Berhasil menumbuhkan kultur kambium tanaman wortel dan tembakau
1941 Overbeek: Penggunaan air kelapa untuk menumbuhkam kultur embrio muda tanaman Datura
1944 Kultur in vitro pertama dari tanaman tembakau untuk studi pembentukan tunas adventif
1948 Skoog dan Tsui: Pembentukan tunas dan akar adventif dari tembakau
1949 Nitsch: Kultur in vitro tanaman buah-buahan
1952 Morel & Martin:
Kultur meristem untuk mendapatkan tanaman Dahlia yang bebas virus
Keberhasilan pertama micro-grafting
1953 Tulecke: Kalus haploid dari polen tanaman Ginkgo biloba
1955 Miller: Penemuan struktur dan sintesa dari kinetin
1957 Skoog & Miller: Menemuan bahwa pembentukan akar dan tunas dalam kultur tergatung pada perbandingan auksin : sitokinin
1958 Maheswari & Rangaswamy: Regenerasi embrio somatik dari nuselus ovul Citrus
Reinert & Steward: Pertumbuhan dan perkembangan kultur suspensi wortel
1960 Cocking: Degradasi enzimatik dinding sel untuk mendapatkan protoplas
Morel: Perbanyakan vegetatif anggrek melalui kultur meristem
1962 Murashige & Skoog: Perkembangan media MS
1964 Guha & Maheswari: Penemuan tanaman haploid pertama melalui androgenesis tanaman Datura
1969 Erickson & Jonassen: Isolasi protoplas dari suspensi sel Hapopappus
1970 Power: Fusi protoplas
1977 Chilton: Keberhasilan integrasi T-DNA pada tanaman
Noguchi dkk.: Penanaman sel-sel tembakau dalam bioreaktor berkapasitas 20 000 L.
1978 Melchers dkk.: Hibridisasi somatik antara tanaman tomat dan kentang
Tabata dkk.: Produksi shikonin pada skala industri melalui kultur sel
1982 Zimmermann: Fusi protoplas secara elektrik (Electrofusion)
1983 Mitsui Petrochemicals: Produksi metabolit sekunder pertama dalam skala industri melalui kultur suspensi pada tanaman Lithospermum spp.
1985-1990 Perkembangan transfer gen pada tanaman berkembang cepat, seperti penggunaan Agrobacterium, particle bombardment (gen gun), electroporasi, mikroinjeksi.
1990 - Perkembangan rekayasa genetik dan metabolik tan. berkembang pesat
Pemasaran produk-produk rekayasa genetik
Kultur Kalus Wortel
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kultur jaringan tanaman merupakan teknik menumbuh-kembangkan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan, atau organ dalam kondisi asebtik secara in-vitro. Teknik ini dicirikan oleh kondisi kultur yang asebtik, pengggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap dan ZPT (zat pengatur tumbuh), serta ruang kultur yang suhu dan pencahayaannya terkontrol.
Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan kadang-kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa kambium vaskular, parenkim cadangan makanan, perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan provaskular. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet.
Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal dengan kalus remah (friable). Warna kalus dapat bermacam-macam tergantung dari jenis sumber eksplan itu diambel, seperti warna kekuning-kuningan, putih, hijau, kuning kejingga-jingaan (karena adanya pigmen antosianin ini terdapat pada kalus kortek umbi wortel).
Dalam kultur kalus, kalus homogen yang tersusun atas sel-sel parenkim jarang dijumpai kecuali pada kultur sel Agave dan Rosa (Narayanaswany (1977 dalam Dodds & Roberts, 1983). Untuk memperoleh kalus yang homogen maka harus menggunakan eksplan jaringan yang mempunyai sel-sel yang seragam. Dalam pertumbuhan kalus, citodiferensiasi terjadi untuk membentuk elemen trachea, buluh tapis, sel gabus, sel sekresi dan trikoma. Kambium dan periderm sebagai contoh dari proses hitogenesis dari kultur kallus. Anaman kecil dari pembelahan sel-sel membentuk meristemoid atau nodul vaskular yang nantinya menjadi pusat dari pembentukan tunas apikal, primordial akar atau embrioid.
Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu penambahan ZPT untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara alamiah pada jaringan berbambium yang mengalami luka akan tumbuh kalus untuk menutupi luka yang terbuka. Namun pada jkasus lain, menurut Kordan (1959 dalam Dodds & Robert, 1983) keberadaan kambium di dalam eksplan tertentu dapat menghambat pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat pengatur tumbuh eksogen. Penambahan ZPT tersebut dapat satu macam atau lebih tergantung dari jenis eksplan yang digunakan. Pembelahan sel di dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT yang digunakan, seperti: 1) auxin; 2) sitokinin; 3) auxin dan sitokinin dan 4) ekstrak senyawa organik komplek alamiah.
B. Tujuan
1. Menginduksi dan menumbuhkan kalus dari jaringan akar wortel
2. Untuk memperoleh kalus dari eksplan wortel yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus diharapkan dapat memperbanyak dirinya (massa selnya) secara terus menerus.
BAB II METODOLOGI
A. Waktu dan Tempat
Waktu pelakanaan praktikum kultur kalus wortel pada hari/tanggal kamis 23 Oktober 2008 pukul 08.00-14.20. Tempat pelaksanaan praktikum ini adalah di laboratorium kultur jaringan Pusat Pengembangan dan Pemberdayaan Pendidik dan Tenaga Kependidikan (PPPPTK) Pertanian Cianjur.
B. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Laminar air flow
b. Alat diseksi
c. Cawan petri
d. Erlenmeyer ukuran 250 ml dan 500 ml
e. Lampu bunsen
2. Bahan
a. Akar/umbi wortel
b. Larutan alkohol 70%
c. Larutan sunclin/bayclin 20%
d. Akuades steril
e. Kertas saring steril
f. Media induksi kalus
MS + 0.1 mg/l 2,4-D
C. Prosedur Kerja
1. Akar wortel yang tidak cacat dicuci dalam air mengalir untuk menghilagkan kotoran pada permukaan akar
2. Potong kedua bagian ujungnya, buat potongan akar menjadi ukuran 6-10 cm lalu masukkan ke dalam erlenmeyer
3. Di dalam laminar air flow, rendam potongan akar tersebut dengan larutan alkohol 70% selama 5 menit sambil dikocok
4. Buang larutan alkohol dan bilas dengan akuades steril. Kemudian masukkan larutan sunclin atau bayclin 20%. Rendam selama 15-25 menit sambil dikocok.
5. Buang larutan sunclin/bayclin, kemudian bilas dengan akuades steril 3-5 kali.
6. Dengan menggunakan pinset, angkat potongan akar dan simpan di atas cawan petri yang diberi alas kertas saring steril.
7. Potong melintang akar setebal 3-5 mm, kemudian buat potongan eksplan ± 5 x 5 mm. Pastikan jaringan kambium (bagian dalam akar) menjadi bagian potongan eksplan.
8. Pindahkan/tanam eksplan tersebut pada media induksi kalus yang sudah disiapkan. Setiap botol kultur berisi 4 potongan eksplan.
9. Tutup botol dengan rapat dan simpan diruang inkubasi dalam keadaan gelap.
10. Amati perkembangannya setiap minggu, selama 4-6 minggu
BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN
A. HASIL
MS + 0.1 mg/l 2,4-D
Pembuatan media ¼ liter atau 250 ml jadi media yang dihasilkan 10 botol. Ditanam eksplan wortel 1 botol 4 eksplan.
B. PEMBAHASAN
Kalus adalah suatu kumpulan sel anorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus-menerus. Kultur kalus bertujuan untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkuangan terkendali. Sel-sel penyusun kalus adalah sel-sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur infitro kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin.
Induksi kalus dalam jaringan wortel ini, disertai dengan aktifitas enzim-enzim NAD-diaphorase succinic dehydrogenase dan cytochrome oxidase yang meningkat. Kenaikan aktifitas enzim terutama dalam lapisan sel yang sedang membelah. Dalam jaringan ini juga ditemukan aktifitas asam fosfatase. Pada fase kultur artichoke, enzim fosfatase diditeksi pada permukaan sel-sel yang tidak membelah. Menurut hipotesa Yeoman pada tahun 1970, asam fosfatase berhubungan dengan sel rusak dan enzim ini adalah index autolysis sel. Pada sel yang rusak tapi tidak pecah di lapisan perisfer, terjadi autolisis dan sel-sel yang rusak tersebut mengeluarkan persenyawaan yang dapat memacu pembelahan sel di lapisan berikutnya.
Sebelum mengkulturkan kalus wortel terlebih dahulu dilakukan pemilihan ekplan. Eksplan yang digunakan untuk induksi kalurs adalah umbi akarnya, tetapi akan lebih baik lagi jika menggunakan jaringan kambium sekitarnya. Umbi wortel yang langsung diambil dari lapangan jauh lebih baik dari pada umbi dari wortel yang dibeli di pasar. Sterilisasi terhadap umbi wortel yang akan dipakai sebagai eksplan dalam kultur jaringan sangat penting karena umbi yang berasal dari tanah umumnya mudah sekali terkontaminasi dan biasanya sterilsasinya agak sulit.
Kontaminasi yang terjadi pada wortel diakibatkan oleh ruangan yang kurang bersih, media yang kurang steril atau penutup media kurang rapat, air yang digunakan, alat-alat yang digunakan dan orang yang melakukan kegiatan. Salah satu faktor pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi dapat dari eksplan baik internal maupun eksternal, organisme kecil yang masuk dalam media, air yang digunakan, botol kultur atau alat-alat tanaman yang kurang steril, lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara), kecerobohan dalam pelaksanaan.
Dengan demikian sterilisasi merupakan hal yang sangat penting dalam kegiatan kultur jaringan. Sterilisasi yang utama harus dilakukan adalah sterilisasi ruang, alat dan bahan karena sterilisasi alat dan bahan sangat pengaruh sekali, adapun alat–alat yang perlu di sterilkan sebelum penanaman adalah pinset, gunting, gagang scapel, petridhis, botol kosong
suhu yang digunakan untuk sterilisasi 121oC pada tekanan 1,5 kgc/cm 2 selama 1 jam, perhitungan waktu sterilisasi setelah tekanan yang diinginkan tercapai.
Kontaminasi disebabkan oleh jamur dan bakteri. Kontaminan ini tumbuh pertama kali pada eksplan kemudian menyebar ke dalam medium, ini menunjukkan bahwa kontaminasi berasal dari eksplan, karena kurangnya sterilisasi terhadap eksplan.
Kontaminasi oleh jamur ditandai dengan munculnya benang-benang yang berwarna putih, yang merupakan miselium jamur. Jamur dapat menginfeksi jaringan secara sistemik (umum tersebar diseluruh organ) terlihat setelah jaringan tersebut dipotong dan akan menyebar sehingga jaringan tersebut akan mati. Sedangkan kontaminasi oleh bakteri ditandai dengan munculnya bercak-bercak putih pada medium terlihat agak berlendir. Bakteri lebih sulit dideteksi dibanding jamur, karena selain menginfeksi secara sistemik bakteri juga akan masuk kedalam ruang antar sel.
A. Latar Belakang
Kultur jaringan tanaman merupakan teknik menumbuh-kembangkan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan, atau organ dalam kondisi asebtik secara in-vitro. Teknik ini dicirikan oleh kondisi kultur yang asebtik, pengggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap dan ZPT (zat pengatur tumbuh), serta ruang kultur yang suhu dan pencahayaannya terkontrol.
Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan kadang-kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa kambium vaskular, parenkim cadangan makanan, perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan provaskular. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet.
Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal dengan kalus remah (friable). Warna kalus dapat bermacam-macam tergantung dari jenis sumber eksplan itu diambel, seperti warna kekuning-kuningan, putih, hijau, kuning kejingga-jingaan (karena adanya pigmen antosianin ini terdapat pada kalus kortek umbi wortel).
Dalam kultur kalus, kalus homogen yang tersusun atas sel-sel parenkim jarang dijumpai kecuali pada kultur sel Agave dan Rosa (Narayanaswany (1977 dalam Dodds & Roberts, 1983). Untuk memperoleh kalus yang homogen maka harus menggunakan eksplan jaringan yang mempunyai sel-sel yang seragam. Dalam pertumbuhan kalus, citodiferensiasi terjadi untuk membentuk elemen trachea, buluh tapis, sel gabus, sel sekresi dan trikoma. Kambium dan periderm sebagai contoh dari proses hitogenesis dari kultur kallus. Anaman kecil dari pembelahan sel-sel membentuk meristemoid atau nodul vaskular yang nantinya menjadi pusat dari pembentukan tunas apikal, primordial akar atau embrioid.
Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu penambahan ZPT untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara alamiah pada jaringan berbambium yang mengalami luka akan tumbuh kalus untuk menutupi luka yang terbuka. Namun pada jkasus lain, menurut Kordan (1959 dalam Dodds & Robert, 1983) keberadaan kambium di dalam eksplan tertentu dapat menghambat pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat pengatur tumbuh eksogen. Penambahan ZPT tersebut dapat satu macam atau lebih tergantung dari jenis eksplan yang digunakan. Pembelahan sel di dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT yang digunakan, seperti: 1) auxin; 2) sitokinin; 3) auxin dan sitokinin dan 4) ekstrak senyawa organik komplek alamiah.
B. Tujuan
1. Menginduksi dan menumbuhkan kalus dari jaringan akar wortel
2. Untuk memperoleh kalus dari eksplan wortel yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus diharapkan dapat memperbanyak dirinya (massa selnya) secara terus menerus.
BAB II METODOLOGI
A. Waktu dan Tempat
Waktu pelakanaan praktikum kultur kalus wortel pada hari/tanggal kamis 23 Oktober 2008 pukul 08.00-14.20. Tempat pelaksanaan praktikum ini adalah di laboratorium kultur jaringan Pusat Pengembangan dan Pemberdayaan Pendidik dan Tenaga Kependidikan (PPPPTK) Pertanian Cianjur.
B. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Laminar air flow
b. Alat diseksi
c. Cawan petri
d. Erlenmeyer ukuran 250 ml dan 500 ml
e. Lampu bunsen
2. Bahan
a. Akar/umbi wortel
b. Larutan alkohol 70%
c. Larutan sunclin/bayclin 20%
d. Akuades steril
e. Kertas saring steril
f. Media induksi kalus
MS + 0.1 mg/l 2,4-D
C. Prosedur Kerja
1. Akar wortel yang tidak cacat dicuci dalam air mengalir untuk menghilagkan kotoran pada permukaan akar
2. Potong kedua bagian ujungnya, buat potongan akar menjadi ukuran 6-10 cm lalu masukkan ke dalam erlenmeyer
3. Di dalam laminar air flow, rendam potongan akar tersebut dengan larutan alkohol 70% selama 5 menit sambil dikocok
4. Buang larutan alkohol dan bilas dengan akuades steril. Kemudian masukkan larutan sunclin atau bayclin 20%. Rendam selama 15-25 menit sambil dikocok.
5. Buang larutan sunclin/bayclin, kemudian bilas dengan akuades steril 3-5 kali.
6. Dengan menggunakan pinset, angkat potongan akar dan simpan di atas cawan petri yang diberi alas kertas saring steril.
7. Potong melintang akar setebal 3-5 mm, kemudian buat potongan eksplan ± 5 x 5 mm. Pastikan jaringan kambium (bagian dalam akar) menjadi bagian potongan eksplan.
8. Pindahkan/tanam eksplan tersebut pada media induksi kalus yang sudah disiapkan. Setiap botol kultur berisi 4 potongan eksplan.
9. Tutup botol dengan rapat dan simpan diruang inkubasi dalam keadaan gelap.
10. Amati perkembangannya setiap minggu, selama 4-6 minggu
BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN
A. HASIL
MS + 0.1 mg/l 2,4-D
Pembuatan media ¼ liter atau 250 ml jadi media yang dihasilkan 10 botol. Ditanam eksplan wortel 1 botol 4 eksplan.
B. PEMBAHASAN
Kalus adalah suatu kumpulan sel anorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus-menerus. Kultur kalus bertujuan untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkuangan terkendali. Sel-sel penyusun kalus adalah sel-sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur infitro kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin.
Induksi kalus dalam jaringan wortel ini, disertai dengan aktifitas enzim-enzim NAD-diaphorase succinic dehydrogenase dan cytochrome oxidase yang meningkat. Kenaikan aktifitas enzim terutama dalam lapisan sel yang sedang membelah. Dalam jaringan ini juga ditemukan aktifitas asam fosfatase. Pada fase kultur artichoke, enzim fosfatase diditeksi pada permukaan sel-sel yang tidak membelah. Menurut hipotesa Yeoman pada tahun 1970, asam fosfatase berhubungan dengan sel rusak dan enzim ini adalah index autolysis sel. Pada sel yang rusak tapi tidak pecah di lapisan perisfer, terjadi autolisis dan sel-sel yang rusak tersebut mengeluarkan persenyawaan yang dapat memacu pembelahan sel di lapisan berikutnya.
Sebelum mengkulturkan kalus wortel terlebih dahulu dilakukan pemilihan ekplan. Eksplan yang digunakan untuk induksi kalurs adalah umbi akarnya, tetapi akan lebih baik lagi jika menggunakan jaringan kambium sekitarnya. Umbi wortel yang langsung diambil dari lapangan jauh lebih baik dari pada umbi dari wortel yang dibeli di pasar. Sterilisasi terhadap umbi wortel yang akan dipakai sebagai eksplan dalam kultur jaringan sangat penting karena umbi yang berasal dari tanah umumnya mudah sekali terkontaminasi dan biasanya sterilsasinya agak sulit.
Kontaminasi yang terjadi pada wortel diakibatkan oleh ruangan yang kurang bersih, media yang kurang steril atau penutup media kurang rapat, air yang digunakan, alat-alat yang digunakan dan orang yang melakukan kegiatan. Salah satu faktor pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi dapat dari eksplan baik internal maupun eksternal, organisme kecil yang masuk dalam media, air yang digunakan, botol kultur atau alat-alat tanaman yang kurang steril, lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara), kecerobohan dalam pelaksanaan.
Dengan demikian sterilisasi merupakan hal yang sangat penting dalam kegiatan kultur jaringan. Sterilisasi yang utama harus dilakukan adalah sterilisasi ruang, alat dan bahan karena sterilisasi alat dan bahan sangat pengaruh sekali, adapun alat–alat yang perlu di sterilkan sebelum penanaman adalah pinset, gunting, gagang scapel, petridhis, botol kosong
suhu yang digunakan untuk sterilisasi 121oC pada tekanan 1,5 kgc/cm 2 selama 1 jam, perhitungan waktu sterilisasi setelah tekanan yang diinginkan tercapai.
Kontaminasi disebabkan oleh jamur dan bakteri. Kontaminan ini tumbuh pertama kali pada eksplan kemudian menyebar ke dalam medium, ini menunjukkan bahwa kontaminasi berasal dari eksplan, karena kurangnya sterilisasi terhadap eksplan.
Kontaminasi oleh jamur ditandai dengan munculnya benang-benang yang berwarna putih, yang merupakan miselium jamur. Jamur dapat menginfeksi jaringan secara sistemik (umum tersebar diseluruh organ) terlihat setelah jaringan tersebut dipotong dan akan menyebar sehingga jaringan tersebut akan mati. Sedangkan kontaminasi oleh bakteri ditandai dengan munculnya bercak-bercak putih pada medium terlihat agak berlendir. Bakteri lebih sulit dideteksi dibanding jamur, karena selain menginfeksi secara sistemik bakteri juga akan masuk kedalam ruang antar sel.
Kultur Protoplas Kacang Panjang (Vigna sinensis L.)
PENDAHULUAN
Kacang panjang (Vigna sinensis L.) merupakan tanaman sayuran penting dari golongan kacangkacangan, karena mengandung nutrisi yang relatif lengkap dan cukup tinggi, terutama protein nabati. Bagian tanaman kacang panjang yang biasa digunakan sebagai sayuran adalah polong muda, biji, dan daun muda (Irfan 1993).Teknik isolasi protoplas diperlukan dalam pemuliaan tanaman untuk menyeleksi dan merakit varietas hibrida secara lebih cepat. Menurut Suryowinoto (1996), isolasi protoplas adalah teknik untuk menghasilkan protoplas yang utuh dan viabel dari jaringan tanaman hidup dengan cara menghilangkan dinding selnya. Menurut Tan (1987), salah satu cara untuk memperoleh protoplas utuh adalah dengan perlakuan gelap pada suhu rendah (4oC) selama 6 jam pada saat isolasi protoplas. Perlakuan ini telah dicobakan pada eksplan mesofil tanaman tomat dengan hasil rendemen protoplas antara 2 x 105 sampai 6 x 105 protoplas/g eksplan. Penghilangan dinding sel dapat dilakukan secara mekanis maupun enzimatis. Secara enzimatis, jenis dan konsentrasi enzim yang digunakan sangat mempengaruhi perolehan protoplas. Dinding sel yang masih muda biasanya tersusun dari pektin dan selulosa. Oleh karena itu, enzim yang paling cocok digunakan adalah Pectinase atau Macerozyme dan Cellulase (Esau 1965; Evans dan Bravo 1983;Pollard dan Walker 1990).
Enzim Pectinase atau Macerozyme berfungsi untuk menghancurkan lamela tengah yang tersusun dan zat pektin, sehingga sel satu dengan sel lainnya terpisah. Proses ini biasa disebut maserasi sel (Sumardi dan Pudjoarinto 1992). Fungsi enzim Cellulase adalah menghancurkan dan melisiskan penebalan primer dari dinding sel yang tersusun atas zat selulosa. Perlakuan kedua enzim tersebut dapat dilakukan dengan dua tahap dan satu tahap. Perlakuan dua tahap adalah dengan cara memasukkan bahan ke dalam larutan enzim secara bergantian dan berurutan dari larutan enzim Macerozyme, kemudian dimasukkan lagi enzim Cellulase. Perlakuan satu tahap adalah dengan cara mencampur kedua enzim tersebut dalam satu larutan untuk mengisolasi protoplas.Pengalaman dari beberapa percobaan menunjukkan bahwa mencampur kedua enzim tersebut merupakan cara yang lebih efektif untuk mengisolasi protoplas tanaman (Evans dan Bravo 1983)..
BAHAN DAN METODE
A. Bahan Tanaman
Bahan tanaman benih kacang panjang hijau lokal yang berasal dari Desa Rejo Mulyo, Pakuan Ratu Blok C SP II, Lampung Utara. Benih dikulturkan dengan media kapas basah dalam botol. Pengkulturan benih dilakukan secara in vitro dengan kondisi aseptik dalam ruang terang selama 13 hari. Kecambah tersebut mempunyai minimal dua daun yang sudah berwarna hijau. Daun-daun ini yang digunakan sebagai donor protoplas. Sebelum dikulturkan, benih disterilisasi dengan bahan pemutih (Baycline) konsentrasi 30%.
B. Pembuatan Media
Ada dua media yang dibuat dan digunakan dalam proses isolasi protoplas, yaitu:
1. EM-medium (elution medium) atau media elusi, yaitu media yang telah dicampur kedua enzim dengan konsentrasi yang sesuai dengan perlakuan untuk proses isolasi protoplas dari mesofil daun kacang panjang. Macam bahan dan konsentrasinya disajikan pada Tabel 1.
Table 1. Komposisi EM-medium atau media untuk isolasi protoplas
No Nama bahan Konsentrasi
C1M1 C2M2 C3M3
1 Cellulase RS* 2,0% 2,5% 3,0%
2 Macerozyme R-10* 0,4% 0,5% 0,6%
3 Mannitol 25 mM 25 mM 25 mM
4 MES (Morpho-Ethana Sulfoxide) 1 mM 1 mM 1 mM
5 pH 5,8 5,8 5,8
* enzim yang digunakan sebagai perlakuan.
2. CPW-medium atau medium pencuci yang biasa disebut PM-medium (purification medium) atau media pemurni/pembersih. Media ini digunakan untuk mencuci dan memurnikan protoplas hasil isolasi dari zat enzim, sehingga protoplas dalam kondisi bersih/murni dan siap dikulturkan atau untuk proses selanjutnya, misalnya untuk fusi atau transfer organela. Macam bahan dan konsentrasi CPW-medium atau PM-medium disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Komposisi CPW-Medium atau media pencuci atau juga disebut medium pemurni
No Nama Bahan Konsentrasi
1 KH2PO4 170,00 μM
2 KNO3 999,00 μM
3 CaCl2.2H2O 10,00 mM
4 MgSO4.7H2O 998,00 μM
5 KI 0,96 μM
6 Cu SO4.5 H2O 1,00 μM
7 Mannitol 600,00 mM
C. Prosedur Kerja
Kecambah tanaman kacang panjang yang berumur 13 hari diambil daunnya (mesofil), kemudian dikumpulkan sebagai bahan donor protoplas. Mesofil yang diperlukan per perlakuan adalah 0,2 g yang sebelumnya dipotong/diiris tipis selebar +1mm, selanjutnya dimasukkan ke dalam 2 ml larutan EM-medium kemudian diinkubasi dalam keadaan gelap selama 3 jam sambil dikocok di atas pengocok atau gyotoric shaker berkecepatan 50 rpm. Perlakuan enzim tersebut merupakan variasi konsentrasi enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10.
Setelah waktu inkubasi tercapai, larutan enzim beserta suspensi protoplas disaring dengan kain Mary-Cloth mesh 200 μm. Suspensi protoplas yang diperoleh disentrifugasi dengan sentrifus merk Hettich Universal berkecepatan 1000 rpm selama 2 menit. Supernatan diambil dengan pipet dan dibuang, sedangkan endapannya ditambah larutan CPW-Medium 1 ml, kemudian disentrifugasi lagi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Protoplas akan mengapung di permukaan larutan, kemudian diambil dengan pipet untuk ditempatkan dalam tabung tersendiri. Protoplas tersebut sudah murni, bersih dari larutan enzim dan siap dikulturkan atau difusikan. Dalam penghitungan densitas atau kerapatan rendemen protoplas hasil isolasi, suspensi protoplas tersebut diteteskan dalam Haemocytometer untuk dihitung densitasnya.
D. Pengamatan dan Analisis Data
Pengamatan dilakukan terhadap rendemen protoplas hasil isolasi. Jumlah protoplas dihitung dengan menggunakan Haemocytometer. Penelitian ini menggunakan metode faktorial dengan pola dasar rancangan acak lengkap, masing-masing perlakuan diulang tiga kali. Data dianalisis dengan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf uji 5%.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pengecambahan Benih
Benih kacang panjang mulai berkecambah pada umur 5-7 hari setelah kultur. Daun mulai mekar (sepasang pertama) pada umur 9-11 hari setelah tanam dan warnanya sudah tampak hijau yang menandakan pembentukan klorofil sudah berlangsung (Gambar 1). Klorofil ini sangat penting karena akan digunakan sebagai marker atau penanda protoplas kacang panjang yang terisolasi. Pada umur +15 hari, daun-daun (bagian mesofil) tersebut diambil dan digunakan sebagai bahan atau donor protoplas yang akan diisolasi secara enzimatis
B. Isolasi Protoplas
1. Pengaruh Perlakuan Enzim Cellulase RS
Perlakuan konsentrasi enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10 maupun gabungan kedua enzim (interaksi) berpengaruh nyata terhadap rendemen protoplas kacang panjang hasil isolasi. Protoplas yang terisolasi umumnya berbentuk intact atau bulat, utuh, dan viabel dengan membran transparan dan bening, sehingga organela atau bagian dalam sel terlihat jelas (Gambar 2). Organela yang terlihat paling jelas adalah klorofil yang menampakkan butiran warna hijau dengan jumlah relatif banyak dan berukuran relatif besar. Oleh karena itu, klorofil ini dijadikan sebagai marker atau penanda dalam identifikasi penghitungan rendemen protoplas hasil isolasi (Patnaik dan Cocking 1982;Suryowinoto 1989).
Protoplas yang terbentuk tampak utuh, tidak mengalami kerusakan dalam inkubasi selama 3 jam yang dikocok dalam pengocok berkecepatan 50 rpm pada kondisi gelap dengan zat osmotikum berupa mannitol 25 mM. Dengan demikian, waktu inkubasi isolasi protoplas kacang panjang asal mesofil daun selama 3 jam dapat dijadikan formula karena mampu memberikan protoplas yang baik. Mannitol 25 mM yang digunakan sebagai osmotikum atau sering disebut sebagai zat antipecah atau anti blasting mampu menjaga kestabilan tekanan antara sitoplasma dengan larutan enzim sehingga protoplas tidak pecah (Suryowinoto 1989).
Penelitian ini sesuai dengan penelitian isolasi protoplas karet yang dilakukan oleh Nurhaimi-Haris et al. (1993), yang menggunakan manitol 6,5-8% sebagai osmotikum dalam larutan enzim yang dikocok pada kondisi gelap. Rendemen protoplas hasil isolasi dengan beberapa konsentrasi Cellulase RS menunjukkan perbedaan yang nyata. Rendemen protoplas tertinggi ditunjukan oleh perlakuan C3 (konsentrasi enzim Cellulase RS 3,0% b/v) sebesar 17,4 x 105 protoplas/g berat segar mesofil daun. Nilai ini jauh lebih tinggi daripada rendemen yang diperoleh perlakuan kontrol (tanpa enzim) yang hanya mencapai 1,72 x 105 protoplas/g. Namun perlakuan C3 tidak berbeda nyata dengan perlakuan C2 (konsentrasi enzim Cellulase RS 2,5% b/v) yang mencapai 15,19 x 105 protoplas/g.
Perlakuan enzim Cellulase RS dapat mengisolasi protoplas dengan rendemen cukup tinggi. Hal ini membuktikan bahwa enzim Cellulase RS secara individual mampu mengisolasi protoplas kacang panjang asal mesofil. Cellulase RS termasuk salah satu jenis enzim yang berfungsi melarutkan dinding sel berupa selulosa. Pengocokan selama 3 jam pada kondisi gelap akan mempercepat proses isolasi protoplas tersebut sehingga dapat meningkatkan rendemen protoplas (Evans dan Cocking 1977; Tan 1987).
Peningkatan densitas rendemen protoplas seiring dengan peningkatan konsentrasi enzim Cellulase RS. Hal ini dimungkinkan adanya proses pelarutan dinding sel selulosa dan derivat-derivatnya yang bergantung pada konsentrasi enzim Cellulase RS yang tepat dan optimum. Suryowinoto (1990) dan Patnaik et al. (1997) mengemukakan bahwa untuk melarutkan dinding sel yang tersusun dari selulosa digunakan enzim Cellulase. Konsentrasi enzim Cellulase RS yang optimum dapat mengisolasi protoplas dalam jumlah lebih banyak dengan kondisi protoplas yang baik (intact).
2. Pengaruh Perlakuan Enzim Macerozyme R-10
Perlakuan konsentrasi enzim Macerozyme R-10 memberikan hasil yang berbeda nyata. Rata-rata rendemen protoplas yang dicapai dari masing-masing perlakuan cukup tinggi dan yang tertinggi dicapai oleh perlakuan M2 (konsentrasi enzim Macerozyme R-10 0,5% b/v), yaitu 17,46 x 105 protoplas/g berat segar mesofil, berbeda nyata dengan semua perlakuan. Tingginya rendemen protoplas dari pertanaman M2, diduga karena konsentrasi enzim Macerozyme R-10 0,5% b/v merupakan konsentrasi yang tepat dan optimum untuk mesofil kacang panjang. Konsentrasi enzim Macerozyme R-10 yang lebih tinggi (M3 : 0,6% b/v) memberikan rendemen protoplas lebih rendah (9,67 x 105 protoplas/g berat segar mesofil) dan hampir sama dengan perlakuan konsentrasi enzim Macerozyme R-10 0,4% b/v (M1) dengan rendemen 9,71 x 105 protoplas/g eksplan. Hal ini sesuai dengan penelitian Nurhaimi-Haris et al. (1993), yang menggunakan enzim Macerozym dengan konsentrasi 0,5% untuk mengisolasi protoplas karet. Enzim Macerozyme R-10 adalah salah satu jenis enzim Pectinase yang berfungsi melarutkan dinding sel primitif yang tersusun atas zat pectin (Sumardi dan Pudjoarianto 1992; Kim dan Lee 1996). Enzim Macerozyme digunakan untuk memisahkan atau maserasi jaringan tanaman sehingga sel-sel tersebut terlepas menjadi sel-sel tunggal dan akhirnya melarutkan dinding sel yang masih tersisa sehingga terbentuk protoplas yang transparan berbentuk bulat dan utuh (Suryowinoto 1990; Patnaik dan Cocking 1982).
C. Pengaruh Perlakuan Interaksi antara Enzim Cellulose RS dengan Macerozyme R-10
Rendemen protoplas kacang panjang hasil isolasi dari perlakuan interaksi antara enzim Macerozyme R-10 dengan enzim Cellulase RS jauh lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan enzim tersebut secara individual. Suryowinoto (1988) melaporkan hal yang sama bahwa penggabungan enzim Macerozyme dengan Cellulase RS memberikan protoplas yang lebih baik.
Interaksi terbaik enzim Cellulase RS dengan Macerozyme R-10 dicapai oleh perlakuan C2M2 (C2 = konsentrasi enzim cellulase RS sebesar 2,5% b/v dan M2 = konsentrasi enzim Macerozyme R-10 sebesar 0,5 b/v) yang menghasilkan nilai densitas tertinggi, yaitu 32,67 x 105 protoplas/g mesofil daun. Angka ini jauh lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan interaksi kedua enzim yang lain. Hal ini diduga interaksi kedua enzim tersebut dengan konsentrasi Cellulase RS 2,5% dan Macerozyme R-10 0,5% merupakan perlakuan kombinasi yang paling tepat dan optimum.
Tingginya rendemen protoplas kacang panjang yang terisolasi dari perlakuan interaksi kedua enzim tersebut, berarti antara enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10 terdapat interaksi positif. Keadaan ini menyebabkan penggabungan kedua enzim tersebut akan terjadi saling tindak atau saling mempengaruhi untuk meningkatkan rendemen protoplas yang terisolasi dibandingkan dengan pengaruh kedua enzim secara individual. Hal ini sesuai dengan pernyataan Suryowinoto (1996) dan Stoldt et al. (1996) yang mengemukakan bahwa untuk proses isolasi protoplas akan lebih baik bila menggunakan kombinasi enzim Cellulase dengan Pectinase seperti Macerozyme. Kombinasi enzim ini akan meningkatkan densitas protoplas hasil isolasi. Protoplas hasil isolasi yang kondisinya baik (bulat, utuh, dan viabel) dalam jumlah cukup siap dikulturkan atau diperlakuan lebih lanjut dengan hasil yang lebih efektif dan efisien dengan potensi keberhasilan yamg lebih tinggi. Perlakuan lanjut dariprotoplas hasil isolasi antara lain adalah kultur protoplas, transfer organella, fusi protoplas intragenerik, dan intergenerik (Evans dan Bravo 1983; Kao dan Michayluck 1974; Hadisantoso dan Syahrani 1988).
KESIMPULAN
Protoplas kacang panjang dapat diisolasi dengan enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10 secara individual maupun kombinasi keduanya. Pada perlakuan isolasi protoplas menggunakan enzim Cellulase RS secara individual, hasil rendemen protoplas tertinggi dicapai oleh perlakuan konsentrasi C3 (3% b/v) dengan densitas 17,4 x 105 protoplas/g berat segar mesofil daun. Pada perlakuan enzim Macerozyme R-10, hasil isolasi protoplas tertinggi sebesar 17,46 x 105 protoplas/g dicapai oleh perlakuan konsentrasi M2 (0,5% b/v). Perlakuan interaksi atau penggabungan antara enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10 menghasilkan rendemen protoplas yang jauh lebih tinggi. Interaksi terbaik dari kedua enzim dicapai oleh perlakuan C2M2 (konsentrasi enzim Cellulase RS 2,5% b/v dan enzim Macerozyme R-10 0,5% b/v) dengan densitas 32,67 x 105 protoplas/g mesofil daun.
DAFTAR PUSTAKA
http://indoplasma.or.id/publikasi/buletin_pn/pdf/buletin_pn_12_2_2006_62-68_imron.pdf
Kacang panjang (Vigna sinensis L.) merupakan tanaman sayuran penting dari golongan kacangkacangan, karena mengandung nutrisi yang relatif lengkap dan cukup tinggi, terutama protein nabati. Bagian tanaman kacang panjang yang biasa digunakan sebagai sayuran adalah polong muda, biji, dan daun muda (Irfan 1993).Teknik isolasi protoplas diperlukan dalam pemuliaan tanaman untuk menyeleksi dan merakit varietas hibrida secara lebih cepat. Menurut Suryowinoto (1996), isolasi protoplas adalah teknik untuk menghasilkan protoplas yang utuh dan viabel dari jaringan tanaman hidup dengan cara menghilangkan dinding selnya. Menurut Tan (1987), salah satu cara untuk memperoleh protoplas utuh adalah dengan perlakuan gelap pada suhu rendah (4oC) selama 6 jam pada saat isolasi protoplas. Perlakuan ini telah dicobakan pada eksplan mesofil tanaman tomat dengan hasil rendemen protoplas antara 2 x 105 sampai 6 x 105 protoplas/g eksplan. Penghilangan dinding sel dapat dilakukan secara mekanis maupun enzimatis. Secara enzimatis, jenis dan konsentrasi enzim yang digunakan sangat mempengaruhi perolehan protoplas. Dinding sel yang masih muda biasanya tersusun dari pektin dan selulosa. Oleh karena itu, enzim yang paling cocok digunakan adalah Pectinase atau Macerozyme dan Cellulase (Esau 1965; Evans dan Bravo 1983;Pollard dan Walker 1990).
Enzim Pectinase atau Macerozyme berfungsi untuk menghancurkan lamela tengah yang tersusun dan zat pektin, sehingga sel satu dengan sel lainnya terpisah. Proses ini biasa disebut maserasi sel (Sumardi dan Pudjoarinto 1992). Fungsi enzim Cellulase adalah menghancurkan dan melisiskan penebalan primer dari dinding sel yang tersusun atas zat selulosa. Perlakuan kedua enzim tersebut dapat dilakukan dengan dua tahap dan satu tahap. Perlakuan dua tahap adalah dengan cara memasukkan bahan ke dalam larutan enzim secara bergantian dan berurutan dari larutan enzim Macerozyme, kemudian dimasukkan lagi enzim Cellulase. Perlakuan satu tahap adalah dengan cara mencampur kedua enzim tersebut dalam satu larutan untuk mengisolasi protoplas.Pengalaman dari beberapa percobaan menunjukkan bahwa mencampur kedua enzim tersebut merupakan cara yang lebih efektif untuk mengisolasi protoplas tanaman (Evans dan Bravo 1983)..
BAHAN DAN METODE
A. Bahan Tanaman
Bahan tanaman benih kacang panjang hijau lokal yang berasal dari Desa Rejo Mulyo, Pakuan Ratu Blok C SP II, Lampung Utara. Benih dikulturkan dengan media kapas basah dalam botol. Pengkulturan benih dilakukan secara in vitro dengan kondisi aseptik dalam ruang terang selama 13 hari. Kecambah tersebut mempunyai minimal dua daun yang sudah berwarna hijau. Daun-daun ini yang digunakan sebagai donor protoplas. Sebelum dikulturkan, benih disterilisasi dengan bahan pemutih (Baycline) konsentrasi 30%.
B. Pembuatan Media
Ada dua media yang dibuat dan digunakan dalam proses isolasi protoplas, yaitu:
1. EM-medium (elution medium) atau media elusi, yaitu media yang telah dicampur kedua enzim dengan konsentrasi yang sesuai dengan perlakuan untuk proses isolasi protoplas dari mesofil daun kacang panjang. Macam bahan dan konsentrasinya disajikan pada Tabel 1.
Table 1. Komposisi EM-medium atau media untuk isolasi protoplas
No Nama bahan Konsentrasi
C1M1 C2M2 C3M3
1 Cellulase RS* 2,0% 2,5% 3,0%
2 Macerozyme R-10* 0,4% 0,5% 0,6%
3 Mannitol 25 mM 25 mM 25 mM
4 MES (Morpho-Ethana Sulfoxide) 1 mM 1 mM 1 mM
5 pH 5,8 5,8 5,8
* enzim yang digunakan sebagai perlakuan.
2. CPW-medium atau medium pencuci yang biasa disebut PM-medium (purification medium) atau media pemurni/pembersih. Media ini digunakan untuk mencuci dan memurnikan protoplas hasil isolasi dari zat enzim, sehingga protoplas dalam kondisi bersih/murni dan siap dikulturkan atau untuk proses selanjutnya, misalnya untuk fusi atau transfer organela. Macam bahan dan konsentrasi CPW-medium atau PM-medium disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Komposisi CPW-Medium atau media pencuci atau juga disebut medium pemurni
No Nama Bahan Konsentrasi
1 KH2PO4 170,00 μM
2 KNO3 999,00 μM
3 CaCl2.2H2O 10,00 mM
4 MgSO4.7H2O 998,00 μM
5 KI 0,96 μM
6 Cu SO4.5 H2O 1,00 μM
7 Mannitol 600,00 mM
C. Prosedur Kerja
Kecambah tanaman kacang panjang yang berumur 13 hari diambil daunnya (mesofil), kemudian dikumpulkan sebagai bahan donor protoplas. Mesofil yang diperlukan per perlakuan adalah 0,2 g yang sebelumnya dipotong/diiris tipis selebar +1mm, selanjutnya dimasukkan ke dalam 2 ml larutan EM-medium kemudian diinkubasi dalam keadaan gelap selama 3 jam sambil dikocok di atas pengocok atau gyotoric shaker berkecepatan 50 rpm. Perlakuan enzim tersebut merupakan variasi konsentrasi enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10.
Setelah waktu inkubasi tercapai, larutan enzim beserta suspensi protoplas disaring dengan kain Mary-Cloth mesh 200 μm. Suspensi protoplas yang diperoleh disentrifugasi dengan sentrifus merk Hettich Universal berkecepatan 1000 rpm selama 2 menit. Supernatan diambil dengan pipet dan dibuang, sedangkan endapannya ditambah larutan CPW-Medium 1 ml, kemudian disentrifugasi lagi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Protoplas akan mengapung di permukaan larutan, kemudian diambil dengan pipet untuk ditempatkan dalam tabung tersendiri. Protoplas tersebut sudah murni, bersih dari larutan enzim dan siap dikulturkan atau difusikan. Dalam penghitungan densitas atau kerapatan rendemen protoplas hasil isolasi, suspensi protoplas tersebut diteteskan dalam Haemocytometer untuk dihitung densitasnya.
D. Pengamatan dan Analisis Data
Pengamatan dilakukan terhadap rendemen protoplas hasil isolasi. Jumlah protoplas dihitung dengan menggunakan Haemocytometer. Penelitian ini menggunakan metode faktorial dengan pola dasar rancangan acak lengkap, masing-masing perlakuan diulang tiga kali. Data dianalisis dengan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf uji 5%.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pengecambahan Benih
Benih kacang panjang mulai berkecambah pada umur 5-7 hari setelah kultur. Daun mulai mekar (sepasang pertama) pada umur 9-11 hari setelah tanam dan warnanya sudah tampak hijau yang menandakan pembentukan klorofil sudah berlangsung (Gambar 1). Klorofil ini sangat penting karena akan digunakan sebagai marker atau penanda protoplas kacang panjang yang terisolasi. Pada umur +15 hari, daun-daun (bagian mesofil) tersebut diambil dan digunakan sebagai bahan atau donor protoplas yang akan diisolasi secara enzimatis
B. Isolasi Protoplas
1. Pengaruh Perlakuan Enzim Cellulase RS
Perlakuan konsentrasi enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10 maupun gabungan kedua enzim (interaksi) berpengaruh nyata terhadap rendemen protoplas kacang panjang hasil isolasi. Protoplas yang terisolasi umumnya berbentuk intact atau bulat, utuh, dan viabel dengan membran transparan dan bening, sehingga organela atau bagian dalam sel terlihat jelas (Gambar 2). Organela yang terlihat paling jelas adalah klorofil yang menampakkan butiran warna hijau dengan jumlah relatif banyak dan berukuran relatif besar. Oleh karena itu, klorofil ini dijadikan sebagai marker atau penanda dalam identifikasi penghitungan rendemen protoplas hasil isolasi (Patnaik dan Cocking 1982;Suryowinoto 1989).
Protoplas yang terbentuk tampak utuh, tidak mengalami kerusakan dalam inkubasi selama 3 jam yang dikocok dalam pengocok berkecepatan 50 rpm pada kondisi gelap dengan zat osmotikum berupa mannitol 25 mM. Dengan demikian, waktu inkubasi isolasi protoplas kacang panjang asal mesofil daun selama 3 jam dapat dijadikan formula karena mampu memberikan protoplas yang baik. Mannitol 25 mM yang digunakan sebagai osmotikum atau sering disebut sebagai zat antipecah atau anti blasting mampu menjaga kestabilan tekanan antara sitoplasma dengan larutan enzim sehingga protoplas tidak pecah (Suryowinoto 1989).
Penelitian ini sesuai dengan penelitian isolasi protoplas karet yang dilakukan oleh Nurhaimi-Haris et al. (1993), yang menggunakan manitol 6,5-8% sebagai osmotikum dalam larutan enzim yang dikocok pada kondisi gelap. Rendemen protoplas hasil isolasi dengan beberapa konsentrasi Cellulase RS menunjukkan perbedaan yang nyata. Rendemen protoplas tertinggi ditunjukan oleh perlakuan C3 (konsentrasi enzim Cellulase RS 3,0% b/v) sebesar 17,4 x 105 protoplas/g berat segar mesofil daun. Nilai ini jauh lebih tinggi daripada rendemen yang diperoleh perlakuan kontrol (tanpa enzim) yang hanya mencapai 1,72 x 105 protoplas/g. Namun perlakuan C3 tidak berbeda nyata dengan perlakuan C2 (konsentrasi enzim Cellulase RS 2,5% b/v) yang mencapai 15,19 x 105 protoplas/g.
Perlakuan enzim Cellulase RS dapat mengisolasi protoplas dengan rendemen cukup tinggi. Hal ini membuktikan bahwa enzim Cellulase RS secara individual mampu mengisolasi protoplas kacang panjang asal mesofil. Cellulase RS termasuk salah satu jenis enzim yang berfungsi melarutkan dinding sel berupa selulosa. Pengocokan selama 3 jam pada kondisi gelap akan mempercepat proses isolasi protoplas tersebut sehingga dapat meningkatkan rendemen protoplas (Evans dan Cocking 1977; Tan 1987).
Peningkatan densitas rendemen protoplas seiring dengan peningkatan konsentrasi enzim Cellulase RS. Hal ini dimungkinkan adanya proses pelarutan dinding sel selulosa dan derivat-derivatnya yang bergantung pada konsentrasi enzim Cellulase RS yang tepat dan optimum. Suryowinoto (1990) dan Patnaik et al. (1997) mengemukakan bahwa untuk melarutkan dinding sel yang tersusun dari selulosa digunakan enzim Cellulase. Konsentrasi enzim Cellulase RS yang optimum dapat mengisolasi protoplas dalam jumlah lebih banyak dengan kondisi protoplas yang baik (intact).
2. Pengaruh Perlakuan Enzim Macerozyme R-10
Perlakuan konsentrasi enzim Macerozyme R-10 memberikan hasil yang berbeda nyata. Rata-rata rendemen protoplas yang dicapai dari masing-masing perlakuan cukup tinggi dan yang tertinggi dicapai oleh perlakuan M2 (konsentrasi enzim Macerozyme R-10 0,5% b/v), yaitu 17,46 x 105 protoplas/g berat segar mesofil, berbeda nyata dengan semua perlakuan. Tingginya rendemen protoplas dari pertanaman M2, diduga karena konsentrasi enzim Macerozyme R-10 0,5% b/v merupakan konsentrasi yang tepat dan optimum untuk mesofil kacang panjang. Konsentrasi enzim Macerozyme R-10 yang lebih tinggi (M3 : 0,6% b/v) memberikan rendemen protoplas lebih rendah (9,67 x 105 protoplas/g berat segar mesofil) dan hampir sama dengan perlakuan konsentrasi enzim Macerozyme R-10 0,4% b/v (M1) dengan rendemen 9,71 x 105 protoplas/g eksplan. Hal ini sesuai dengan penelitian Nurhaimi-Haris et al. (1993), yang menggunakan enzim Macerozym dengan konsentrasi 0,5% untuk mengisolasi protoplas karet. Enzim Macerozyme R-10 adalah salah satu jenis enzim Pectinase yang berfungsi melarutkan dinding sel primitif yang tersusun atas zat pectin (Sumardi dan Pudjoarianto 1992; Kim dan Lee 1996). Enzim Macerozyme digunakan untuk memisahkan atau maserasi jaringan tanaman sehingga sel-sel tersebut terlepas menjadi sel-sel tunggal dan akhirnya melarutkan dinding sel yang masih tersisa sehingga terbentuk protoplas yang transparan berbentuk bulat dan utuh (Suryowinoto 1990; Patnaik dan Cocking 1982).
C. Pengaruh Perlakuan Interaksi antara Enzim Cellulose RS dengan Macerozyme R-10
Rendemen protoplas kacang panjang hasil isolasi dari perlakuan interaksi antara enzim Macerozyme R-10 dengan enzim Cellulase RS jauh lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan enzim tersebut secara individual. Suryowinoto (1988) melaporkan hal yang sama bahwa penggabungan enzim Macerozyme dengan Cellulase RS memberikan protoplas yang lebih baik.
Interaksi terbaik enzim Cellulase RS dengan Macerozyme R-10 dicapai oleh perlakuan C2M2 (C2 = konsentrasi enzim cellulase RS sebesar 2,5% b/v dan M2 = konsentrasi enzim Macerozyme R-10 sebesar 0,5 b/v) yang menghasilkan nilai densitas tertinggi, yaitu 32,67 x 105 protoplas/g mesofil daun. Angka ini jauh lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan interaksi kedua enzim yang lain. Hal ini diduga interaksi kedua enzim tersebut dengan konsentrasi Cellulase RS 2,5% dan Macerozyme R-10 0,5% merupakan perlakuan kombinasi yang paling tepat dan optimum.
Tingginya rendemen protoplas kacang panjang yang terisolasi dari perlakuan interaksi kedua enzim tersebut, berarti antara enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10 terdapat interaksi positif. Keadaan ini menyebabkan penggabungan kedua enzim tersebut akan terjadi saling tindak atau saling mempengaruhi untuk meningkatkan rendemen protoplas yang terisolasi dibandingkan dengan pengaruh kedua enzim secara individual. Hal ini sesuai dengan pernyataan Suryowinoto (1996) dan Stoldt et al. (1996) yang mengemukakan bahwa untuk proses isolasi protoplas akan lebih baik bila menggunakan kombinasi enzim Cellulase dengan Pectinase seperti Macerozyme. Kombinasi enzim ini akan meningkatkan densitas protoplas hasil isolasi. Protoplas hasil isolasi yang kondisinya baik (bulat, utuh, dan viabel) dalam jumlah cukup siap dikulturkan atau diperlakuan lebih lanjut dengan hasil yang lebih efektif dan efisien dengan potensi keberhasilan yamg lebih tinggi. Perlakuan lanjut dariprotoplas hasil isolasi antara lain adalah kultur protoplas, transfer organella, fusi protoplas intragenerik, dan intergenerik (Evans dan Bravo 1983; Kao dan Michayluck 1974; Hadisantoso dan Syahrani 1988).
KESIMPULAN
Protoplas kacang panjang dapat diisolasi dengan enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10 secara individual maupun kombinasi keduanya. Pada perlakuan isolasi protoplas menggunakan enzim Cellulase RS secara individual, hasil rendemen protoplas tertinggi dicapai oleh perlakuan konsentrasi C3 (3% b/v) dengan densitas 17,4 x 105 protoplas/g berat segar mesofil daun. Pada perlakuan enzim Macerozyme R-10, hasil isolasi protoplas tertinggi sebesar 17,46 x 105 protoplas/g dicapai oleh perlakuan konsentrasi M2 (0,5% b/v). Perlakuan interaksi atau penggabungan antara enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10 menghasilkan rendemen protoplas yang jauh lebih tinggi. Interaksi terbaik dari kedua enzim dicapai oleh perlakuan C2M2 (konsentrasi enzim Cellulase RS 2,5% b/v dan enzim Macerozyme R-10 0,5% b/v) dengan densitas 32,67 x 105 protoplas/g mesofil daun.
DAFTAR PUSTAKA
http://indoplasma.or.id/publikasi/buletin_pn/pdf/buletin_pn_12_2_2006_62-68_imron.pdf
Kultur Jaringan Daun Gloxinia
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus menerus. Penelitian pembentukan kalus pada jaringan terluka pertama kali dilakukan oleh Sinnott pada tahun 1960. Pembentukan kalus pada jaringan luka dipacu oleh zat pengatur tumbuh auxin dan sitokinin endogen (Dodds & Roberts, 1983). Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan kadang-kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa kambium vaskular, parenkim cadangan makanan, perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan provaskular. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet.
Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu penambahan ZPT untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara alamiah pada jaringan berbambium yang mengalami luka akan tumbuh kalus untuk menutupi luka yang terbuka. Namun pada kasus lain, menurut Kordan (1959 dalam Dodds & Robert, 1983) keberadaan kambium di dalam eksplan tertentu dapat menghambat pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat pengatur tumbuh eksogen. Penambahan ZPT tersebut dapat satu macam atau lebih tergantung dari jenis eksplan yang digunakan. Pembelahan sel di dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT yang digunakan, seperti: 1) auxin; 2) sitokinin; 3) auxin dan sitokinin dan 4) ekstrak senyawa organik komplek alamiah.
Sel-sel yang heterogen dari jaringan yang komplek menunjukkan pertumbuhan yang berbeda. Dengan mengubah komposisi media, terjadi seleksi sel-sel yang mempunyai sifat khusus. Hal ini berarti bahwa media tumbuh menentukan komposisi kalus. Sel yang jumlahnya paling banyak merupakan sel-sel yang paling cepat membelah dan sel yang paling sedikit adalah sel yang paling lambat pertumbuhannya. Media seleksi dapat berdasarkan unsur-unsur hara atau zat pengatur tumbuh yang ditambahkan ke dalam media.
B. Tujuan
Mengetahui pengaruh zat pengatur tumbuh terhadap
organogenesis jaringan daun Gloxinia
BAB II METODOLOGI
A. Waktu dan Tempat
Waktu pelakanaan praktikum kultur gloxiniapada hari/tanggal kamis 23 Oktober 2008 pukul 08.00-14.20. Tempat pelaksanaan praktikum ini adalah di laboratorium kultur jaringan Pusat Pengembangan dan Pemberdayaan Pendidik dan Tenaga Kependidikan (PPPPTK) Pertanian Cianjur.
B. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Laminar air flow
b. Alat diseksi
c. Cawan petri
d. Lampu bunsen
2. Bahan
a. Biakan in vitro Gloxinia
b. Kertas saring steril
c. Media regenerasi
1) MS
2) MS + 0.5 mg/l NAA
3)
C. Prosedur Kerja
1. Di dalam laminar flow, ambil plantlet Gloxinia dengan menggunakan pinset. Simpan diatas cawan petri steril, kemudian pisahkan bagian daunnya.
2. Buat potongan daun dengan ukuran ± 5 x 5 mm.
3. Pindahkan/tanam eksplan tersebut pada botol kultur yang berisi media regenerasi yang sudah disiapkan. Setiap botol kultur berisi 4 potongan eksplan.
4. Tutup botol dengan rapat dan simpan diruang inkubasi dalam keadaan bercahaya.
5. Amati perkembangannya setiap minggu, selama 4-6 minggu
A. Latar Belakang
Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus menerus. Penelitian pembentukan kalus pada jaringan terluka pertama kali dilakukan oleh Sinnott pada tahun 1960. Pembentukan kalus pada jaringan luka dipacu oleh zat pengatur tumbuh auxin dan sitokinin endogen (Dodds & Roberts, 1983). Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan kadang-kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa kambium vaskular, parenkim cadangan makanan, perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan provaskular. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet.
Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu penambahan ZPT untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara alamiah pada jaringan berbambium yang mengalami luka akan tumbuh kalus untuk menutupi luka yang terbuka. Namun pada kasus lain, menurut Kordan (1959 dalam Dodds & Robert, 1983) keberadaan kambium di dalam eksplan tertentu dapat menghambat pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat pengatur tumbuh eksogen. Penambahan ZPT tersebut dapat satu macam atau lebih tergantung dari jenis eksplan yang digunakan. Pembelahan sel di dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT yang digunakan, seperti: 1) auxin; 2) sitokinin; 3) auxin dan sitokinin dan 4) ekstrak senyawa organik komplek alamiah.
Sel-sel yang heterogen dari jaringan yang komplek menunjukkan pertumbuhan yang berbeda. Dengan mengubah komposisi media, terjadi seleksi sel-sel yang mempunyai sifat khusus. Hal ini berarti bahwa media tumbuh menentukan komposisi kalus. Sel yang jumlahnya paling banyak merupakan sel-sel yang paling cepat membelah dan sel yang paling sedikit adalah sel yang paling lambat pertumbuhannya. Media seleksi dapat berdasarkan unsur-unsur hara atau zat pengatur tumbuh yang ditambahkan ke dalam media.
B. Tujuan
Mengetahui pengaruh zat pengatur tumbuh terhadap
organogenesis jaringan daun Gloxinia
BAB II METODOLOGI
A. Waktu dan Tempat
Waktu pelakanaan praktikum kultur gloxiniapada hari/tanggal kamis 23 Oktober 2008 pukul 08.00-14.20. Tempat pelaksanaan praktikum ini adalah di laboratorium kultur jaringan Pusat Pengembangan dan Pemberdayaan Pendidik dan Tenaga Kependidikan (PPPPTK) Pertanian Cianjur.
B. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Laminar air flow
b. Alat diseksi
c. Cawan petri
d. Lampu bunsen
2. Bahan
a. Biakan in vitro Gloxinia
b. Kertas saring steril
c. Media regenerasi
1) MS
2) MS + 0.5 mg/l NAA
3)
C. Prosedur Kerja
1. Di dalam laminar flow, ambil plantlet Gloxinia dengan menggunakan pinset. Simpan diatas cawan petri steril, kemudian pisahkan bagian daunnya.
2. Buat potongan daun dengan ukuran ± 5 x 5 mm.
3. Pindahkan/tanam eksplan tersebut pada botol kultur yang berisi media regenerasi yang sudah disiapkan. Setiap botol kultur berisi 4 potongan eksplan.
4. Tutup botol dengan rapat dan simpan diruang inkubasi dalam keadaan bercahaya.
5. Amati perkembangannya setiap minggu, selama 4-6 minggu
Induksi Mutasi pada Kultur Kalus Secara Kimiawi dan Seleksi Terhadap Kekering
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Perubahan genetik dapat terjadi selama periode kultur in vitro atau karena adanya sel-sel yang bermutan pada jaringan induknya. Mutasi spontan pada sel somatik berkisar 0,2 – 3%. Keragaman tersebut dapat ditingkatkan dengan berbagai perlakuan antara lain pemberian mutagen (baik fisik seperti radiasi sinar gamma maupun kimiawi seperti EMS, ES, DEMS) atau pemberian kondisi stress pada kumpulan sel somatik yang bersifat embriogenik. Melalui seleksi in vitro telah terbukti dapat dihasilkan varietas baru yang lebih tahan terhadap faktor biotik dan abiotik dengan sifatnya yang diwariskan.
Seleksi in vitro untuk ketahanan terhadap kekeringan umumnya menggunakan polyethylene glycol (PEG) sebagai komponen seleksi. Polyethylene glycol adalah senyawa yang stabil, non ionik, polymer panjang yang larut dalam air dan dapat digunakan dalam sebaran berat molekul yang luas. PEG dengan berat molekul lebih dari 4000 dapat menginduksi stress air pada tanaman dengan mengurangi potensial air pada larutan nutrisi tanpa menyebabkan keracunan.
Perubahan genetik dapat terjadi selama periode kultur in vitro atau karena adanya sel-sel yang bermutan pada jaringan induknya. Mutasi spontan pada sel somatik berkisar 0,2 – 3%. Keragaman tersebut dapat ditingkatkan dengan berbagai perlakuan antara lain pemberian mutagen (baik fisik seperti radiasi sinar gamma maupun kimiawi seperti EMS, ES, DEMS) atau pemberian kondisi stress pada kumpulan sel somatik yang bersifat embriogenik. Melalui seleksi in vitro telah terbukti dapat dihasilkan varietas baru yang lebih tahan terhadap faktor biotik dan abiotik dengan sifatnya yang diwariskan.
Seleksi in vitro untuk ketahanan terhadap kekeringan umumnya menggunakan polyethylene glycol (PEG) sebagai komponen seleksi. Polyethylene glycol adalah senyawa yang stabil, non ionik, polymer panjang yang larut dalam air dan dapat digunakan dalam sebaran berat molekul yang luas. PEG dengan berat molekul lebih dari 4000 dapat menginduksi stress air pada tanaman dengan mengurangi potensial air pada larutan nutrisi tanpa menyebabkan keracunan.
Melalui kultur in vitro disamping dapat menghasilkan berbagai somaklon untuk tujuan perbaikan sifat tanaman dapat pula dimanfaatkan untuk menapis berbagai nomor dalam “gen pool” yang ada. Menurut Sirait (2001) dibanding dengan metode konvensional penapisan secara in vitro untuk sifat toleran terhadap faktor abiotik mempunyai keunggulan komparatif antara lain periode seleksi lebih singkat, area/luasan untuk seleksi lebih sedikit, mudah dikontrol dan tidak dibatasi oleh musim.
ALAT DAN BAHAN:
Alat:
1. Laminar air flow
2. Alat diseksi
3. Cawan petri
4. Erlenmeyer uk. 250 ml dan 500 ml
5. Lampu bunsen
6. Syringe
7. Millipore filter
Bahan:
1. Biakan kalus tebu
2. Larutan EMS 0.5%
3. Polyetilen glycol (PEG6000)
4. Akuades steril
5. Kertas saring steril
6. Media seleksi
• MS + BAP 1 mg/l + sukrosa 30 g/l + agar swallow 8 g/l
LANGKAH KERJA:
1. Siapkan erlenmeyer vol.250 ml atau botol kultur steril untuk perendaman eksplan kalus dengan larutan EMS.
2. Masukkan ± 50 ml larutan EMS 0.5% ke dalam botol steril tsb. sambil disterilisasi menggunakan “syringe” dan filter millipore 0.2 mikron.
3. Masukkan kalus tebu dari 2 botol yang telah disiapkan ke dalam larutan EMS 0.5% tersebut secara hati-hati.
4. Lakukan penggojokan/goyang menggunakan shaker pada kecepatan 50-60 rpm selama 1 jam dalam keadaan gelap.
5. Setelah itu buang larutan EMS (hati-hati) dan bilas kalaus dengan akuades steril sebanyak 3 kali.
6. Kalus yang telah diinduksi mutasi tsb. dipindahkan pada media seleksi kekeringan yang mengandung PEG 6000 pada taraf konsentrasi 0, 10, dan 20 % (komposisi lihat pada bahan).
7. Inkubasi kalus pada kondisi terang, Kalus yang masih hidup pada media seleksi selama + 1 bulan kemudian di sub kultur pada media regenerasi MS + BAP 1 mg/l + sukrosa 30 g/l + agar swallow 8 g/l.
Hasil dan pembahasan
Tabel 9. pengamatan kultur protoplasma tanaman tebu dan anggrek
No Jenis
tanaman Tgl
tanam pengamatan
Minggu
I Minggu
II Minggu III Minggu IV
1 Daun Anggrek Sabtu 29-11-08 Belum ada respon Belum ada respon Belum ada respon Belum ada respon
A. Latar Belakang
Perubahan genetik dapat terjadi selama periode kultur in vitro atau karena adanya sel-sel yang bermutan pada jaringan induknya. Mutasi spontan pada sel somatik berkisar 0,2 – 3%. Keragaman tersebut dapat ditingkatkan dengan berbagai perlakuan antara lain pemberian mutagen (baik fisik seperti radiasi sinar gamma maupun kimiawi seperti EMS, ES, DEMS) atau pemberian kondisi stress pada kumpulan sel somatik yang bersifat embriogenik. Melalui seleksi in vitro telah terbukti dapat dihasilkan varietas baru yang lebih tahan terhadap faktor biotik dan abiotik dengan sifatnya yang diwariskan.
Seleksi in vitro untuk ketahanan terhadap kekeringan umumnya menggunakan polyethylene glycol (PEG) sebagai komponen seleksi. Polyethylene glycol adalah senyawa yang stabil, non ionik, polymer panjang yang larut dalam air dan dapat digunakan dalam sebaran berat molekul yang luas. PEG dengan berat molekul lebih dari 4000 dapat menginduksi stress air pada tanaman dengan mengurangi potensial air pada larutan nutrisi tanpa menyebabkan keracunan.
Perubahan genetik dapat terjadi selama periode kultur in vitro atau karena adanya sel-sel yang bermutan pada jaringan induknya. Mutasi spontan pada sel somatik berkisar 0,2 – 3%. Keragaman tersebut dapat ditingkatkan dengan berbagai perlakuan antara lain pemberian mutagen (baik fisik seperti radiasi sinar gamma maupun kimiawi seperti EMS, ES, DEMS) atau pemberian kondisi stress pada kumpulan sel somatik yang bersifat embriogenik. Melalui seleksi in vitro telah terbukti dapat dihasilkan varietas baru yang lebih tahan terhadap faktor biotik dan abiotik dengan sifatnya yang diwariskan.
Seleksi in vitro untuk ketahanan terhadap kekeringan umumnya menggunakan polyethylene glycol (PEG) sebagai komponen seleksi. Polyethylene glycol adalah senyawa yang stabil, non ionik, polymer panjang yang larut dalam air dan dapat digunakan dalam sebaran berat molekul yang luas. PEG dengan berat molekul lebih dari 4000 dapat menginduksi stress air pada tanaman dengan mengurangi potensial air pada larutan nutrisi tanpa menyebabkan keracunan.
Melalui kultur in vitro disamping dapat menghasilkan berbagai somaklon untuk tujuan perbaikan sifat tanaman dapat pula dimanfaatkan untuk menapis berbagai nomor dalam “gen pool” yang ada. Menurut Sirait (2001) dibanding dengan metode konvensional penapisan secara in vitro untuk sifat toleran terhadap faktor abiotik mempunyai keunggulan komparatif antara lain periode seleksi lebih singkat, area/luasan untuk seleksi lebih sedikit, mudah dikontrol dan tidak dibatasi oleh musim.
ALAT DAN BAHAN:
Alat:
1. Laminar air flow
2. Alat diseksi
3. Cawan petri
4. Erlenmeyer uk. 250 ml dan 500 ml
5. Lampu bunsen
6. Syringe
7. Millipore filter
Bahan:
1. Biakan kalus tebu
2. Larutan EMS 0.5%
3. Polyetilen glycol (PEG6000)
4. Akuades steril
5. Kertas saring steril
6. Media seleksi
• MS + BAP 1 mg/l + sukrosa 30 g/l + agar swallow 8 g/l
LANGKAH KERJA:
1. Siapkan erlenmeyer vol.250 ml atau botol kultur steril untuk perendaman eksplan kalus dengan larutan EMS.
2. Masukkan ± 50 ml larutan EMS 0.5% ke dalam botol steril tsb. sambil disterilisasi menggunakan “syringe” dan filter millipore 0.2 mikron.
3. Masukkan kalus tebu dari 2 botol yang telah disiapkan ke dalam larutan EMS 0.5% tersebut secara hati-hati.
4. Lakukan penggojokan/goyang menggunakan shaker pada kecepatan 50-60 rpm selama 1 jam dalam keadaan gelap.
5. Setelah itu buang larutan EMS (hati-hati) dan bilas kalaus dengan akuades steril sebanyak 3 kali.
6. Kalus yang telah diinduksi mutasi tsb. dipindahkan pada media seleksi kekeringan yang mengandung PEG 6000 pada taraf konsentrasi 0, 10, dan 20 % (komposisi lihat pada bahan).
7. Inkubasi kalus pada kondisi terang, Kalus yang masih hidup pada media seleksi selama + 1 bulan kemudian di sub kultur pada media regenerasi MS + BAP 1 mg/l + sukrosa 30 g/l + agar swallow 8 g/l.
Hasil dan pembahasan
Tabel 9. pengamatan kultur protoplasma tanaman tebu dan anggrek
No Jenis
tanaman Tgl
tanam pengamatan
Minggu
I Minggu
II Minggu III Minggu IV
1 Daun Anggrek Sabtu 29-11-08 Belum ada respon Belum ada respon Belum ada respon Belum ada respon
Langganan:
Postingan (Atom)
