Kultur Anther Tanaman Padi dan Asparagus

I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Pemuliaan tanaman merupakan kegiatan untuk mengubah susunan genetik tanaman secara tetap sehingga memiliki sifat atau penampilan sesuai dengan tujuan yang diinginkan pelakunya. Pemuliaan tanaman umumnya mencakup tindakan penangkaran, persilangan, dan seleksi. Produk pemuliaan tanaman adalah kultivar dengan ciri-ciri yang khusus dan bermanfaat bagi penanamnya. Dalam kerangka usaha pertanian (agribisnis), pemuliaan tanaman merupakan bagian awal/hulu dari mata rantai usaha tani dan memastikan tersedianya benih dan bahan tanam yang baik dan bermutu tinggi (Anonim, 2008).

Tujuan dalam pemuliaan tanaman secara umum diarahkan pada dua hal: peningkatan kepastian terhadap hasil yang tinggi dan perbaikan kualitas produk yang dihasilkan diantaranya menghasilkan tanaman yang haploid melalui kultur anther dan transformasi genetik dari tanaman satu ke tanaman lain yang umumnya secara seksual sering mengalami hambatan alamiah seperti:(i) inkompabilitas; (ii) sterilitas, baik dari polen maupun ovul; atau (iii) sifat tanaman yang diinginkan tidak terdapat dalam populasi tanaman yang cross-fertile.

Kultur anther adalah kultur aseptik anther untuk memproduksi kalus atau tanaman haploid dari mikrospora. Kultur anther merupakan suatu metoda untuk memproduksi galur-galur yang homozygot dalam waktu yang relatif lebih cepat dibandingkan dengan metoda konvensional yang memerlukan beberapa generasi (Deden Sukmadjaja, 2008).
Tanaman haploid ganda (double haploid atau dihaploid) yang dihasilkan melalui kultur anther bersifat homozygot dan murni. Penggunaan tanaman haploid ganda dalam pemuliaan akan lebih efisien dalam mengidentifikasi genotip-genotip superior karena tanaman tersebut akan mengekspresikan sifat-sifatnya. Kultur anther mula-mula dikenalkan oleh Guha dan Maheswari pada tahun 1964. Metode kultur anther untuk mendapatkan tanaman haploid telah digunakan pada lebih dari 200 spesies tanaman termasuk tomat, padi, tembakau, geranium, asparagus, dan lain-lain (Deden Sukmadjaja, 2008).

Secara konvensional, transfer materi genetik dari satu tanaman ke tanaman lain umumnya dilakukan melalui siklus seksual dengan penyilangan-penyilangan. Tidak seperti pada sel hewan, sel tanaman dibatasi oleh dinding sel yang terdiri dari serabut-serabut selulosa yang kuat. Antara sel yang satu dan sel yang lain terdapat perekat yang tersusun dalam matrik dari bahan-bahan yang mengandung pektin. Sel tanaman yang telah didegradasi dinding selnya disebut protoplasma.

Protoplasma dapat diisolasi baik secara mekanik maupun secara enzimatik. Isolasi secara mekanik saat ini sudah tidak dilakukan lagi karena sudah tidak efisien. Isolasi protoplasma secara enzimatik merupakan cara yang umum dilakukan. Teknik ini mula-mula dikembangkan oleh Cocking tahun 1960 dengan menggunakan enzim selular dari cendawan Myrothecium verrucaria. Enzim ini mula-mula dipergunakan untuk mendapatkan protoplasma dari akar tomat tetapi kemudian juga dapat digunakan untuk berbagai jaringan lain (Deden Sukmadjaja, 2008).

Bahan tanaman yang biasanya digunakan sebagai sumber protoplasma adalah daun muda, kalus, atau agregat sel dalam kultur suspensi sel. Jaringan mesofil pada daun merupakan jaringan yang paling mudah diisolasi karena sel-selnya tersusun secara renggang sehingga enzim-enzim mudah mencapai dinding sel. Daun muda atau pucuk dari biakan in vitro merupakan sumber yang lebih disukai karena sudah dalam keadaan steril. Kultur sel yang akan digunakan sebagai sumber protoplasma harus berasal dari kultur yang berumur muda antara 3-5 hari. Protoplasma membutuhkan tekanan osmotik yang sesuai sampai dinding selnya terbentuk kembali baik dalam proses isolasi maupun selama periode kultur (Deden Sukmadjaja, 2008).

Salah satu aplikasi penggunaan protoplasma yang paling penting adalah untuk hibridisasi somatik. Hibridisasi somatik khususnya diperlukan apabila metode pemuliaan secara konvensional sukar atau tidak dapat dilakukan seperti adanya inkompabilitas tanaman sehingga proses persilangan mengalami kegagalan. Fusi protoplasma dapat terjadi secara spontan atau dengan cara diinduksi pada kondisi khusus. Fusi protplasma dari sumber sel yang berbeda jarang terjadi secara spontan dan umumnya harus diinduksi dengan beberapa perlakuan baik secara kimiawi atau fisik. Induksi fusi secara kimiawi antara lain dengan NaNO3, pH tinggi/konsentrasi Ca++ konsentrasi tinggi dan polietilen glikol (PEG). Sedangkan induksi secara fisik adalah dengan mengalirkan listrik menggunakan alat fusi elektrik (elektrofusion). Teknik fusi protoplasma dengan menggunakan PEG dan elektrofusion merupakan cara yang paling banyak digunakan karena tingkat keberhasilannya lebih tinggi dibanding dengan teknik yang lain (Deden Sukmadjaja, 2008).

B. Tujuan
Adapun tujuan dilakukannya praktikum ini adalah :
1. Mengetahui teknik-teknik pemuliaan tanaman melalui kultur jaringan
2. Megetahui cara penanaman antera padi dan asparagus secara in vitro Induksi kalus padi dan asparagus yang berasal dari antera padi dan asparagus
3. Megetahui teknik isolasi dan kultur protoplasma tanaman tebu dan anggrek

II METODOLOGI
A. Waktu dan Tempat
Waktu pelakanaan praktikum kultur antera tanaman padi dan asparagus pada hari/tanggal Sabtu 15 November 2008 pukul 09.00-14.30 dan pelaksanaan praktikum Isolasi dan kultur protoplasma tanaman tebu dan biakan in vitro daun anggrek pada hari/tanggal Sabtu 29 November 2008 pukul 09.00-15.00. Tempat pelaksanaan praktikum ini adalah di laboratorium kultur jaringan tanaman Pusat Pengembangan dan Pemberdayaan Pendidik dan Tenaga Kependidikan (PPPPTK) Pertanian Cianjur.

B. Alat Dan Bahan
1. Alat
a. Laminar air flow
b. Alat diseksi
c. Cawan petri 100 x 15 mm, 60 x 10 mm dan 40 x 10 mm
d. Botol steril
e. Lampu bunsen
f. Centrifuge
g. Haemocytometer
h. Tabung sentrifugasi uk. 15 ml steril
i. Mikroskop
j. Pipet pasteur steril
k. Millipore filter
l. Syringe
m. Nilon filter 60-80 µm

2. Bahan
a. Antera padi dan asparagus
b. Sterilan (Alkohol 70%, Bayclin/Sunclin 20%)
c. Akuades steril
d. Kertas saring steril
e. Media kultur antera (dalam cawan petri):
MS + 2,4-D 1 mg/l + BAP 0.1 mg/l + NAA 0.5 mg/l + sukrosa 50 g/l + agar swallow 8 g/l, pH media 5.8
f. Kalus tebu dan biakan in vitro daun anggrek
g. Larutan enzim: 2% selulase + 0,1% pektiolase + 0,5% maserozim + 0,5% drisilase yang di larutkan dalam larutan CPW + 13% manitol
h. Larutan CPW + 13 manitol
i. Media kultur protoplama KpR
j. Larutan sukrosa 20-25%

C. Prosedur Kerja kultur antera tanaman padi dan asparagus
1. Siapkan peralatan dan bahan untuk sterilisasi antera padi dan asparagus di dalam laminar air flow. Bahan tanaman berupa malai padi dan bunga asparagus seblumnya sudah dilakukan ”pretreatment” dengan suhu dingin 5-10oC selama 5 hari.
2. Buka batang padi yang berisi malai dengan menggunakan pisau. Potong tangkai malai dan masukkan dalam botol steril. Begitu pula dengan bunga asparagus, pisahkan bunga yang masih kuncup dan masukan dalam botol steril.
3. Secara terpisah, sterilkan kedua bunga tersebut dengan merendam secara berurutan dalam alkohol 70% selama 2 menit, kemudian dilanjutkan dengan bayclin/sunclin 20% selama 20 menit. Setelah itu bilas dengan akuades steril sebanyak 3-5 kali.
4. Setelah dibilas pindahkan bunga pada cawan petri steril yang beralas kertas saring.
5. Untuk memudahkan isolasi/penanaman antera padi pada media, potong kurang lebih 1/3 bagian bulir bunga padi dari bagian pangkal bulir. Demikian puladengan bunga asparagus.
6. Jepit bagian ujung bulir/bunga yang tidak dipotong dengan menggunakan pinset. Arahkan bagian bulir/bunga yang telah dipotong pada permukaan media, kemudian ketukkan pinset pada bibit cawan sehingga antera jatuh pada permukaan media.
7. Satu cawan petri ukuran 100 x 15 mm sebaiknya berisi 100-120 antera.
8. Tutup cawan petri dan rekatkan dengan menggunakan parafilm.
9. Inkubasi biakan antera dalam pada suhu ruang dalam keadaan gelap.
10. Setelah dua minggu, amati pembentukan kalus setiap minggu.

D. Prosedur Kerja isolasi dan kultur protoplasma tanaman tebu dab daun anggrek
1. Siapkan 2 cawan petri steril uk. 60 x 10 mm di dalam laminar. Pindahkan kalus tebu dan daun anggrek ari botol kultur ke dalam cawan petri tersebut secara hati-hati.
2. Iris daun anggrek tipis-tipis (lebar 1-2 mm) dengan menggunakan pisau yang tajam.
3. Rendam kedua sumber protoplasma tersebut dengan larutan enzim yang telah disediakan dengan menggunakan filter millipore dan syringe. Volume enzim yang digunakan ± 5 ml untuk tiap
4. Tutup cawan petri dan beri rekatkan dengan parafilm, kemudian bungkus dengan alumunium foil. Simpan cawan berisi enzim dan sumber protoplasma tersebut diatas shaker dan atur kecepatannya 40-50 rpm. Biarkan selama 3-4 jam, amati setiap 1 jam dengan cara mengambil contoh larutan dengan mengunakan pipet pasteur dan teteskan diatas kaca objek. Kemudian amati pada mikroskop.
5. Setelah jumlah protoplasma dianggap cukup banyak, saring larutan dengan nylon filter dan masukan kedalam tabung sentrifugasi steril. Kerjakan didalam lamnar dan lakukan pemindahan larutan secara hati-hati dengan menggunakan pipet pasteur steril.
6. Setelah dipindahkan dalam tabung sentrifugasi, masukan tabung dalam alat sentrifugasi. Putar dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit.
7. Setelah sentrifugasi, protoplasma dan kotoran (’debris’) akan mengendap didasar tabung. Buang larutan enzim yang berada diatasnya dengan menggunakan pipet pasteur secara perlahan dan hati-hati.
8. Untuk mencuci protoplasma dari sisa enzim, masukan larutan CPW + 13% manitol kedalam tabung secara perlahan menggunakan pipet pasteur. Sambil memasukan larutan CPW, resuspensi protoplas + debris yang ada didasar tabung dengan pipet pasteur secara perlahan-lahan. Setelah teresuspensi, buat volumenya hingga 12 ml.
9. Tutup tabung, kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Lakukan pencucian ini sebanyak 2 kali.
10. Pada pencucian kedua, buat volumenya hingga 10 ml kemudian tambahkan diatasnya larutan sukrosa 20-25% secara perlahan. Sentrifugasi kembali dengan kecepatan agak rendah (1000 rpm) selama 5 menit.
11. Protoplasma akan terpisah berada pada lapisan atas tabung, sedangkan debris ada pada bagian dasar tabung.
12. Ambil protoplasma dengan hati-hati menggunakan pipet pasteur. Masukkan dalam tabung atau cawan petri steril uk. 40 x 10 cm. Encerkan protoplasma 5-10 kali konsentrasi dengan menambahkan medium KpR.
13. Amati densitasnya dengan cara mengambil contoh larutan protoplasma dengan pipet tetes dan teteskandiatas haemocytometer.
14. Amati dan hitung densitas protoplasma pada mikroskop.
15. Untuk mengkulturkan protoplasma, teteskan larutan protoplasma diatas media KpR padat atau cair.

III HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
1. Hasil kutur anthera tanaman padi dan asparagus
Hasil dari praktikum kultur anthera tanaman padi dan tanaman asparagus
Media yang digunakan Media kultur antera (dalam botol kecil):
MS + 2,4-D 1 mg/l + BAP 0.1 mg/l + NAA 0.5 mg/l + sukrosa 50 g/l + agar swallow 8 g/l, pH media 5.8. media dibuat dalam 500 ml dan dimasukkan dalam botol kultur yang kecil sebanyak 10 ml/botol sehingga media yang dihasilkan adalah 50 botol kultur yang kecil(botol selei).
Media tersebut ditanam untuk kultur anther padi dan asparagus. Untuk asparagus 25 botol dan media padi 25 botol.
Tabel 1. pengamatan minggu pertama Senin 24 November 2008 tanaman asparagus
No
botol Jumlah eksplan kontaminasi Respon pertumbuhan (pembengkakan) Keterangan
Jamur Bakteri
1 15 - - - Belum ada perkembangan (pembengkakan)
2 15 - - -
3 15 - - -
4 15 - - -
5 15 - - -

Tabel 2. pengamatan minggu kedua Senin 01 Desember 2008 tanaman asparagus
No
botol Jumlah eksplan kontaminasi Respon pertumbuhan (pembengkakan) Keterangan
Jamur Bakteri
1 15 - - - Belum ada perkembangan (pembengkakan)
2 15 - - -
3 15 - - -
4 15 - - -
5 15 - - -
Tabel 3. Pengamatan minggu ketiga Rabu 10 Desember 2008 tanaman asparagus
No
botol Jumlah eksplan kontaminasi Respon pertumbuhan (pembengkakan) Keterangan
Jamur Bakteri
1 15 - - 5 Sisa belum ada pembengkakan
2 15 - - 10
3 15 - - 6
4 15 - - 1
5 15 - - 7

Tabel 4. Pengamatan minggu keempat Senin 15 Desember 2008 tanaman asparagus
No
Botol Jumla eksplan kontaminasi Respon Pertumbuhan
(pembengkakan) keterangan
Jamur Bakteri
1 15 - - 6 Sisa belum ada pembengkakan
2 15 - - 10
3 15 - - 6
4 15 - - 2 Sisa mati
5 15 - - 7 Sisa belum ada pembenkakan

Tabel 5. Pengamatan minggu pertama Senin 24 November 2008 tanaman padi
No
botol Jumlah eksplan kontaminasi Respon pertumbuhan (pembengkakan) Keterangan
Jamur Bakteri
1 10 - - - Belum ada perkembangan (pembengkakan)
2 10 - - -
3 10 - - -
4 10 - - -
5 10 - - -

Tabel 6. Pengamatan minggu pertama Senin 01 Desember 2008 tanaman padi
No
botol Jumlah eksplan kontaminasi Respon pertumbuhan (pembengkakan) Keterangan
Jamur Bakteri
1 10 - - - Belum ada perkembangan (pembengkakan)
2 10 - - -
3 10 - - -
4 10 - - -
5 10 - - -

Tabel 7. Pengamatan minggu pertama Senin 10 Desember 2008 tanaman padi
No
botol Jumlah eksplan kontaminasi Respon pertumbuhan (pembengkakan) Keterangan
Jamur Bakteri
1 10 - - - Belum ada perkembangan (pembengkakan)
2 10 - - -
3 10 - - -
4 10 - - -
5 10 - - -

Tabel 8. pengamatan minggu pertama Senin 15 Desember 2008 tanaman padi
No
botol Jumlah eksplan kontaminasi Respon pertumbuhan (pembengkakan) Keterangan
Jamur Bakteri
1 10 - - - Belum ada perkembangan (pembengkakan)
2 10 - - -
3 10 - - -
4 10 - - -
5 10 - - -
2. Hasil isolasi dan kultur protoplas tanaman tebu dan biakan in vitro daun anggrek
belum ada perubahan/perkembangan sampai sekarang
Tabel 9. pengamatan kultur protoplasma tanaman tebu dan anggrek
No Jenis
tanaman Tgl
tanam pengamatan
Minggu
I Minggu
II Minggu III Minggu IV
1 Daun Anggrek Sabtu 29-11-08 Belum ada respon Belum ada respon Belum ada respon Belum ada respon
2 Kalus tebu Sabtu 29-11-08 Belum ada respon Belum ada respon Belum ada respon Belum ada respon