Kultur Kalus Wortel

I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kultur jaringan tanaman merupakan teknik menumbuh-kembangkan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan, atau organ dalam kondisi asebtik secara in-vitro. Teknik ini dicirikan oleh kondisi kultur yang asebtik, pengggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap dan ZPT (zat pengatur tumbuh), serta ruang kultur yang suhu dan pencahayaannya terkontrol.
Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan kadang-kadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa kambium vaskular, parenkim cadangan makanan, perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan provaskular. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet.
Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal dengan kalus remah (friable). Warna kalus dapat bermacam-macam tergantung dari jenis sumber eksplan itu diambel, seperti warna kekuning-kuningan, putih, hijau, kuning kejingga-jingaan (karena adanya pigmen antosianin ini terdapat pada kalus kortek umbi wortel).
Dalam kultur kalus, kalus homogen yang tersusun atas sel-sel parenkim jarang dijumpai kecuali pada kultur sel Agave dan Rosa (Narayanaswany (1977 dalam Dodds & Roberts, 1983). Untuk memperoleh kalus yang homogen maka harus menggunakan eksplan jaringan yang mempunyai sel-sel yang seragam. Dalam pertumbuhan kalus, citodiferensiasi terjadi untuk membentuk elemen trachea, buluh tapis, sel gabus, sel sekresi dan trikoma. Kambium dan periderm sebagai contoh dari proses hitogenesis dari kultur kallus. Anaman kecil dari pembelahan sel-sel membentuk meristemoid atau nodul vaskular yang nantinya menjadi pusat dari pembentukan tunas apikal, primordial akar atau embrioid.
Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu penambahan ZPT untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara alamiah pada jaringan berbambium yang mengalami luka akan tumbuh kalus untuk menutupi luka yang terbuka. Namun pada jkasus lain, menurut Kordan (1959 dalam Dodds & Robert, 1983) keberadaan kambium di dalam eksplan tertentu dapat menghambat pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat pengatur tumbuh eksogen. Penambahan ZPT tersebut dapat satu macam atau lebih tergantung dari jenis eksplan yang digunakan. Pembelahan sel di dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT yang digunakan, seperti: 1) auxin; 2) sitokinin; 3) auxin dan sitokinin dan 4) ekstrak senyawa organik komplek alamiah.


B. Tujuan
1. Menginduksi dan menumbuhkan kalus dari jaringan akar wortel
2. Untuk memperoleh kalus dari eksplan wortel yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus diharapkan dapat memperbanyak dirinya (massa selnya) secara terus menerus.

BAB II METODOLOGI
A. Waktu dan Tempat
Waktu pelakanaan praktikum kultur kalus wortel pada hari/tanggal kamis 23 Oktober 2008 pukul 08.00-14.20. Tempat pelaksanaan praktikum ini adalah di laboratorium kultur jaringan Pusat Pengembangan dan Pemberdayaan Pendidik dan Tenaga Kependidikan (PPPPTK) Pertanian Cianjur.
B. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Laminar air flow
b. Alat diseksi
c. Cawan petri
d. Erlenmeyer ukuran 250 ml dan 500 ml
e. Lampu bunsen
2. Bahan
a. Akar/umbi wortel
b. Larutan alkohol 70%
c. Larutan sunclin/bayclin 20%
d. Akuades steril
e. Kertas saring steril
f. Media induksi kalus
MS + 0.1 mg/l 2,4-D

C. Prosedur Kerja
1. Akar wortel yang tidak cacat dicuci dalam air mengalir untuk menghilagkan kotoran pada permukaan akar
2. Potong kedua bagian ujungnya, buat potongan akar menjadi ukuran 6-10 cm lalu masukkan ke dalam erlenmeyer
3. Di dalam laminar air flow, rendam potongan akar tersebut dengan larutan alkohol 70% selama 5 menit sambil dikocok
4. Buang larutan alkohol dan bilas dengan akuades steril. Kemudian masukkan larutan sunclin atau bayclin 20%. Rendam selama 15-25 menit sambil dikocok.
5. Buang larutan sunclin/bayclin, kemudian bilas dengan akuades steril 3-5 kali.
6. Dengan menggunakan pinset, angkat potongan akar dan simpan di atas cawan petri yang diberi alas kertas saring steril.
7. Potong melintang akar setebal 3-5 mm, kemudian buat potongan eksplan ± 5 x 5 mm. Pastikan jaringan kambium (bagian dalam akar) menjadi bagian potongan eksplan.
8. Pindahkan/tanam eksplan tersebut pada media induksi kalus yang sudah disiapkan. Setiap botol kultur berisi 4 potongan eksplan.
9. Tutup botol dengan rapat dan simpan diruang inkubasi dalam keadaan gelap.
10. Amati perkembangannya setiap minggu, selama 4-6 minggu

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN
A. HASIL
MS + 0.1 mg/l 2,4-D
Pembuatan media ¼ liter atau 250 ml jadi media yang dihasilkan 10 botol. Ditanam eksplan wortel 1 botol 4 eksplan.

B. PEMBAHASAN
Kalus adalah suatu kumpulan sel anorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus-menerus. Kultur kalus bertujuan untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkuangan terkendali. Sel-sel penyusun kalus adalah sel-sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur infitro kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin.

Induksi kalus dalam jaringan wortel ini, disertai dengan aktifitas enzim-enzim NAD-diaphorase succinic dehydrogenase dan cytochrome oxidase yang meningkat. Kenaikan aktifitas enzim terutama dalam lapisan sel yang sedang membelah. Dalam jaringan ini juga ditemukan aktifitas asam fosfatase. Pada fase kultur artichoke, enzim fosfatase diditeksi pada permukaan sel-sel yang tidak membelah. Menurut hipotesa Yeoman pada tahun 1970, asam fosfatase berhubungan dengan sel rusak dan enzim ini adalah index autolysis sel. Pada sel yang rusak tapi tidak pecah di lapisan perisfer, terjadi autolisis dan sel-sel yang rusak tersebut mengeluarkan persenyawaan yang dapat memacu pembelahan sel di lapisan berikutnya.

Sebelum mengkulturkan kalus wortel terlebih dahulu dilakukan pemilihan ekplan. Eksplan yang digunakan untuk induksi kalurs adalah umbi akarnya, tetapi akan lebih baik lagi jika menggunakan jaringan kambium sekitarnya. Umbi wortel yang langsung diambil dari lapangan jauh lebih baik dari pada umbi dari wortel yang dibeli di pasar. Sterilisasi terhadap umbi wortel yang akan dipakai sebagai eksplan dalam kultur jaringan sangat penting karena umbi yang berasal dari tanah umumnya mudah sekali terkontaminasi dan biasanya sterilsasinya agak sulit.

Kontaminasi yang terjadi pada wortel diakibatkan oleh ruangan yang kurang bersih, media yang kurang steril atau penutup media kurang rapat, air yang digunakan, alat-alat yang digunakan dan orang yang melakukan kegiatan. Salah satu faktor pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi dapat dari eksplan baik internal maupun eksternal, organisme kecil yang masuk dalam media, air yang digunakan, botol kultur atau alat-alat tanaman yang kurang steril, lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara), kecerobohan dalam pelaksanaan.

Dengan demikian sterilisasi merupakan hal yang sangat penting dalam kegiatan kultur jaringan. Sterilisasi yang utama harus dilakukan adalah sterilisasi ruang, alat dan bahan karena sterilisasi alat dan bahan sangat pengaruh sekali, adapun alat–alat yang perlu di sterilkan sebelum penanaman adalah pinset, gunting, gagang scapel, petridhis, botol kosong
suhu yang digunakan untuk sterilisasi 121oC pada tekanan 1,5 kgc/cm 2 selama 1 jam, perhitungan waktu sterilisasi setelah tekanan yang diinginkan tercapai.

Kontaminasi disebabkan oleh jamur dan bakteri. Kontaminan ini tumbuh pertama kali pada eksplan kemudian menyebar ke dalam medium, ini menunjukkan bahwa kontaminasi berasal dari eksplan, karena kurangnya sterilisasi terhadap eksplan.

Kontaminasi oleh jamur ditandai dengan munculnya benang-benang yang berwarna putih, yang merupakan miselium jamur. Jamur dapat menginfeksi jaringan secara sistemik (umum tersebar diseluruh organ) terlihat setelah jaringan tersebut dipotong dan akan menyebar sehingga jaringan tersebut akan mati. Sedangkan kontaminasi oleh bakteri ditandai dengan munculnya bercak-bercak putih pada medium terlihat agak berlendir. Bakteri lebih sulit dideteksi dibanding jamur, karena selain menginfeksi secara sistemik bakteri juga akan masuk kedalam ruang antar sel.