Kultur Protoplas Kacang Panjang (Vigna sinensis L.)

PENDAHULUAN

Kacang panjang (Vigna sinensis L.) merupakan tanaman sayuran penting dari golongan kacangkacangan, karena mengandung nutrisi yang relatif lengkap dan cukup tinggi, terutama protein nabati. Bagian tanaman kacang panjang yang biasa digunakan sebagai sayuran adalah polong muda, biji, dan daun muda (Irfan 1993).Teknik isolasi protoplas diperlukan dalam pemuliaan tanaman untuk menyeleksi dan merakit varietas hibrida secara lebih cepat. Menurut Suryowinoto (1996), isolasi protoplas adalah teknik untuk menghasilkan protoplas yang utuh dan viabel dari jaringan tanaman hidup dengan cara menghilangkan dinding selnya. Menurut Tan (1987), salah satu cara untuk memperoleh protoplas utuh adalah dengan perlakuan gelap pada suhu rendah (4oC) selama 6 jam pada saat isolasi protoplas. Perlakuan ini telah dicobakan pada eksplan mesofil tanaman tomat dengan hasil rendemen protoplas antara 2 x 105 sampai 6 x 105 protoplas/g eksplan. Penghilangan dinding sel dapat dilakukan secara mekanis maupun enzimatis. Secara enzimatis, jenis dan konsentrasi enzim yang digunakan sangat mempengaruhi perolehan protoplas. Dinding sel yang masih muda biasanya tersusun dari pektin dan selulosa. Oleh karena itu, enzim yang paling cocok digunakan adalah Pectinase atau Macerozyme dan Cellulase (Esau 1965; Evans dan Bravo 1983;Pollard dan Walker 1990).
Enzim Pectinase atau Macerozyme berfungsi untuk menghancurkan lamela tengah yang tersusun dan zat pektin, sehingga sel satu dengan sel lainnya terpisah. Proses ini biasa disebut maserasi sel (Sumardi dan Pudjoarinto 1992). Fungsi enzim Cellulase adalah menghancurkan dan melisiskan penebalan primer dari dinding sel yang tersusun atas zat selulosa. Perlakuan kedua enzim tersebut dapat dilakukan dengan dua tahap dan satu tahap. Perlakuan dua tahap adalah dengan cara memasukkan bahan ke dalam larutan enzim secara bergantian dan berurutan dari larutan enzim Macerozyme, kemudian dimasukkan lagi enzim Cellulase. Perlakuan satu tahap adalah dengan cara mencampur kedua enzim tersebut dalam satu larutan untuk mengisolasi protoplas.Pengalaman dari beberapa percobaan menunjukkan bahwa mencampur kedua enzim tersebut merupakan cara yang lebih efektif untuk mengisolasi protoplas tanaman (Evans dan Bravo 1983)..
BAHAN DAN METODE

A. Bahan Tanaman
Bahan tanaman benih kacang panjang hijau lokal yang berasal dari Desa Rejo Mulyo, Pakuan Ratu Blok C SP II, Lampung Utara. Benih dikulturkan dengan media kapas basah dalam botol. Pengkulturan benih dilakukan secara in vitro dengan kondisi aseptik dalam ruang terang selama 13 hari. Kecambah tersebut mempunyai minimal dua daun yang sudah berwarna hijau. Daun-daun ini yang digunakan sebagai donor protoplas. Sebelum dikulturkan, benih disterilisasi dengan bahan pemutih (Baycline) konsentrasi 30%.
B. Pembuatan Media
Ada dua media yang dibuat dan digunakan dalam proses isolasi protoplas, yaitu:
1. EM-medium (elution medium) atau media elusi, yaitu media yang telah dicampur kedua enzim dengan konsentrasi yang sesuai dengan perlakuan untuk proses isolasi protoplas dari mesofil daun kacang panjang. Macam bahan dan konsentrasinya disajikan pada Tabel 1.

Table 1. Komposisi EM-medium atau media untuk isolasi protoplas
No Nama bahan Konsentrasi
C1M1 C2M2 C3M3
1 Cellulase RS* 2,0% 2,5% 3,0%
2 Macerozyme R-10* 0,4% 0,5% 0,6%
3 Mannitol 25 mM 25 mM 25 mM
4 MES (Morpho-Ethana Sulfoxide) 1 mM 1 mM 1 mM
5 pH 5,8 5,8 5,8
* enzim yang digunakan sebagai perlakuan.





2. CPW-medium atau medium pencuci yang biasa disebut PM-medium (purification medium) atau media pemurni/pembersih. Media ini digunakan untuk mencuci dan memurnikan protoplas hasil isolasi dari zat enzim, sehingga protoplas dalam kondisi bersih/murni dan siap dikulturkan atau untuk proses selanjutnya, misalnya untuk fusi atau transfer organela. Macam bahan dan konsentrasi CPW-medium atau PM-medium disajikan pada Tabel 2.

Tabel 2. Komposisi CPW-Medium atau media pencuci atau juga disebut medium pemurni
No Nama Bahan Konsentrasi
1 KH2PO4 170,00 μM
2 KNO3 999,00 μM
3 CaCl2.2H2O 10,00 mM
4 MgSO4.7H2O 998,00 μM
5 KI 0,96 μM
6 Cu SO4.5 H2O 1,00 μM
7 Mannitol 600,00 mM

C. Prosedur Kerja
Kecambah tanaman kacang panjang yang berumur 13 hari diambil daunnya (mesofil), kemudian dikumpulkan sebagai bahan donor protoplas. Mesofil yang diperlukan per perlakuan adalah 0,2 g yang sebelumnya dipotong/diiris tipis selebar +1mm, selanjutnya dimasukkan ke dalam 2 ml larutan EM-medium kemudian diinkubasi dalam keadaan gelap selama 3 jam sambil dikocok di atas pengocok atau gyotoric shaker berkecepatan 50 rpm. Perlakuan enzim tersebut merupakan variasi konsentrasi enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10.
Setelah waktu inkubasi tercapai, larutan enzim beserta suspensi protoplas disaring dengan kain Mary-Cloth mesh 200 μm. Suspensi protoplas yang diperoleh disentrifugasi dengan sentrifus merk Hettich Universal berkecepatan 1000 rpm selama 2 menit. Supernatan diambil dengan pipet dan dibuang, sedangkan endapannya ditambah larutan CPW-Medium 1 ml, kemudian disentrifugasi lagi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Protoplas akan mengapung di permukaan larutan, kemudian diambil dengan pipet untuk ditempatkan dalam tabung tersendiri. Protoplas tersebut sudah murni, bersih dari larutan enzim dan siap dikulturkan atau difusikan. Dalam penghitungan densitas atau kerapatan rendemen protoplas hasil isolasi, suspensi protoplas tersebut diteteskan dalam Haemocytometer untuk dihitung densitasnya.
D. Pengamatan dan Analisis Data
Pengamatan dilakukan terhadap rendemen protoplas hasil isolasi. Jumlah protoplas dihitung dengan menggunakan Haemocytometer. Penelitian ini menggunakan metode faktorial dengan pola dasar rancangan acak lengkap, masing-masing perlakuan diulang tiga kali. Data dianalisis dengan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf uji 5%.

HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pengecambahan Benih
Benih kacang panjang mulai berkecambah pada umur 5-7 hari setelah kultur. Daun mulai mekar (sepasang pertama) pada umur 9-11 hari setelah tanam dan warnanya sudah tampak hijau yang menandakan pembentukan klorofil sudah berlangsung (Gambar 1). Klorofil ini sangat penting karena akan digunakan sebagai marker atau penanda protoplas kacang panjang yang terisolasi. Pada umur +15 hari, daun-daun (bagian mesofil) tersebut diambil dan digunakan sebagai bahan atau donor protoplas yang akan diisolasi secara enzimatis

B. Isolasi Protoplas
1. Pengaruh Perlakuan Enzim Cellulase RS
Perlakuan konsentrasi enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10 maupun gabungan kedua enzim (interaksi) berpengaruh nyata terhadap rendemen protoplas kacang panjang hasil isolasi. Protoplas yang terisolasi umumnya berbentuk intact atau bulat, utuh, dan viabel dengan membran transparan dan bening, sehingga organela atau bagian dalam sel terlihat jelas (Gambar 2). Organela yang terlihat paling jelas adalah klorofil yang menampakkan butiran warna hijau dengan jumlah relatif banyak dan berukuran relatif besar. Oleh karena itu, klorofil ini dijadikan sebagai marker atau penanda dalam identifikasi penghitungan rendemen protoplas hasil isolasi (Patnaik dan Cocking 1982;Suryowinoto 1989).

Protoplas yang terbentuk tampak utuh, tidak mengalami kerusakan dalam inkubasi selama 3 jam yang dikocok dalam pengocok berkecepatan 50 rpm pada kondisi gelap dengan zat osmotikum berupa mannitol 25 mM. Dengan demikian, waktu inkubasi isolasi protoplas kacang panjang asal mesofil daun selama 3 jam dapat dijadikan formula karena mampu memberikan protoplas yang baik. Mannitol 25 mM yang digunakan sebagai osmotikum atau sering disebut sebagai zat antipecah atau anti blasting mampu menjaga kestabilan tekanan antara sitoplasma dengan larutan enzim sehingga protoplas tidak pecah (Suryowinoto 1989).
Penelitian ini sesuai dengan penelitian isolasi protoplas karet yang dilakukan oleh Nurhaimi-Haris et al. (1993), yang menggunakan manitol 6,5-8% sebagai osmotikum dalam larutan enzim yang dikocok pada kondisi gelap. Rendemen protoplas hasil isolasi dengan beberapa konsentrasi Cellulase RS menunjukkan perbedaan yang nyata. Rendemen protoplas tertinggi ditunjukan oleh perlakuan C3 (konsentrasi enzim Cellulase RS 3,0% b/v) sebesar 17,4 x 105 protoplas/g berat segar mesofil daun. Nilai ini jauh lebih tinggi daripada rendemen yang diperoleh perlakuan kontrol (tanpa enzim) yang hanya mencapai 1,72 x 105 protoplas/g. Namun perlakuan C3 tidak berbeda nyata dengan perlakuan C2 (konsentrasi enzim Cellulase RS 2,5% b/v) yang mencapai 15,19 x 105 protoplas/g.
Perlakuan enzim Cellulase RS dapat mengisolasi protoplas dengan rendemen cukup tinggi. Hal ini membuktikan bahwa enzim Cellulase RS secara individual mampu mengisolasi protoplas kacang panjang asal mesofil. Cellulase RS termasuk salah satu jenis enzim yang berfungsi melarutkan dinding sel berupa selulosa. Pengocokan selama 3 jam pada kondisi gelap akan mempercepat proses isolasi protoplas tersebut sehingga dapat meningkatkan rendemen protoplas (Evans dan Cocking 1977; Tan 1987).
Peningkatan densitas rendemen protoplas seiring dengan peningkatan konsentrasi enzim Cellulase RS. Hal ini dimungkinkan adanya proses pelarutan dinding sel selulosa dan derivat-derivatnya yang bergantung pada konsentrasi enzim Cellulase RS yang tepat dan optimum. Suryowinoto (1990) dan Patnaik et al. (1997) mengemukakan bahwa untuk melarutkan dinding sel yang tersusun dari selulosa digunakan enzim Cellulase. Konsentrasi enzim Cellulase RS yang optimum dapat mengisolasi protoplas dalam jumlah lebih banyak dengan kondisi protoplas yang baik (intact).

2. Pengaruh Perlakuan Enzim Macerozyme R-10
Perlakuan konsentrasi enzim Macerozyme R-10 memberikan hasil yang berbeda nyata. Rata-rata rendemen protoplas yang dicapai dari masing-masing perlakuan cukup tinggi dan yang tertinggi dicapai oleh perlakuan M2 (konsentrasi enzim Macerozyme R-10 0,5% b/v), yaitu 17,46 x 105 protoplas/g berat segar mesofil, berbeda nyata dengan semua perlakuan. Tingginya rendemen protoplas dari pertanaman M2, diduga karena konsentrasi enzim Macerozyme R-10 0,5% b/v merupakan konsentrasi yang tepat dan optimum untuk mesofil kacang panjang. Konsentrasi enzim Macerozyme R-10 yang lebih tinggi (M3 : 0,6% b/v) memberikan rendemen protoplas lebih rendah (9,67 x 105 protoplas/g berat segar mesofil) dan hampir sama dengan perlakuan konsentrasi enzim Macerozyme R-10 0,4% b/v (M1) dengan rendemen 9,71 x 105 protoplas/g eksplan. Hal ini sesuai dengan penelitian Nurhaimi-Haris et al. (1993), yang menggunakan enzim Macerozym dengan konsentrasi 0,5% untuk mengisolasi protoplas karet. Enzim Macerozyme R-10 adalah salah satu jenis enzim Pectinase yang berfungsi melarutkan dinding sel primitif yang tersusun atas zat pectin (Sumardi dan Pudjoarianto 1992; Kim dan Lee 1996). Enzim Macerozyme digunakan untuk memisahkan atau maserasi jaringan tanaman sehingga sel-sel tersebut terlepas menjadi sel-sel tunggal dan akhirnya melarutkan dinding sel yang masih tersisa sehingga terbentuk protoplas yang transparan berbentuk bulat dan utuh (Suryowinoto 1990; Patnaik dan Cocking 1982).

C. Pengaruh Perlakuan Interaksi antara Enzim Cellulose RS dengan Macerozyme R-10
Rendemen protoplas kacang panjang hasil isolasi dari perlakuan interaksi antara enzim Macerozyme R-10 dengan enzim Cellulase RS jauh lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan enzim tersebut secara individual. Suryowinoto (1988) melaporkan hal yang sama bahwa penggabungan enzim Macerozyme dengan Cellulase RS memberikan protoplas yang lebih baik.
Interaksi terbaik enzim Cellulase RS dengan Macerozyme R-10 dicapai oleh perlakuan C2M2 (C2 = konsentrasi enzim cellulase RS sebesar 2,5% b/v dan M2 = konsentrasi enzim Macerozyme R-10 sebesar 0,5 b/v) yang menghasilkan nilai densitas tertinggi, yaitu 32,67 x 105 protoplas/g mesofil daun. Angka ini jauh lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan interaksi kedua enzim yang lain. Hal ini diduga interaksi kedua enzim tersebut dengan konsentrasi Cellulase RS 2,5% dan Macerozyme R-10 0,5% merupakan perlakuan kombinasi yang paling tepat dan optimum.
Tingginya rendemen protoplas kacang panjang yang terisolasi dari perlakuan interaksi kedua enzim tersebut, berarti antara enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10 terdapat interaksi positif. Keadaan ini menyebabkan penggabungan kedua enzim tersebut akan terjadi saling tindak atau saling mempengaruhi untuk meningkatkan rendemen protoplas yang terisolasi dibandingkan dengan pengaruh kedua enzim secara individual. Hal ini sesuai dengan pernyataan Suryowinoto (1996) dan Stoldt et al. (1996) yang mengemukakan bahwa untuk proses isolasi protoplas akan lebih baik bila menggunakan kombinasi enzim Cellulase dengan Pectinase seperti Macerozyme. Kombinasi enzim ini akan meningkatkan densitas protoplas hasil isolasi. Protoplas hasil isolasi yang kondisinya baik (bulat, utuh, dan viabel) dalam jumlah cukup siap dikulturkan atau diperlakuan lebih lanjut dengan hasil yang lebih efektif dan efisien dengan potensi keberhasilan yamg lebih tinggi. Perlakuan lanjut dariprotoplas hasil isolasi antara lain adalah kultur protoplas, transfer organella, fusi protoplas intragenerik, dan intergenerik (Evans dan Bravo 1983; Kao dan Michayluck 1974; Hadisantoso dan Syahrani 1988).


KESIMPULAN
Protoplas kacang panjang dapat diisolasi dengan enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10 secara individual maupun kombinasi keduanya. Pada perlakuan isolasi protoplas menggunakan enzim Cellulase RS secara individual, hasil rendemen protoplas tertinggi dicapai oleh perlakuan konsentrasi C3 (3% b/v) dengan densitas 17,4 x 105 protoplas/g berat segar mesofil daun. Pada perlakuan enzim Macerozyme R-10, hasil isolasi protoplas tertinggi sebesar 17,46 x 105 protoplas/g dicapai oleh perlakuan konsentrasi M2 (0,5% b/v). Perlakuan interaksi atau penggabungan antara enzim Cellulase RS dan Macerozyme R-10 menghasilkan rendemen protoplas yang jauh lebih tinggi. Interaksi terbaik dari kedua enzim dicapai oleh perlakuan C2M2 (konsentrasi enzim Cellulase RS 2,5% b/v dan enzim Macerozyme R-10 0,5% b/v) dengan densitas 32,67 x 105 protoplas/g mesofil daun.


DAFTAR PUSTAKA
http://indoplasma.or.id/publikasi/buletin_pn/pdf/buletin_pn_12_2_2006_62-68_imron.pdf